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瑟瑞娜生命科学技术发展（上海）有限公司
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技术资料/正文
细胞培养那点事——细胞复苏、传代与冻存操作流程（LOVO 人结肠癌细胞）
372 人阅读发布时间：2025-12-03 11:32
复苏
1) 将恒温水浴锅中的水预热到 37℃;
2) 准备一支 15ml 离心管，加入 5ml 含 10% FBS 的完全培养基，放入 37℃水浴锅中预热；
3) 戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入 37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率；
4) 将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中，混匀后，1000 rpm 离心5min；
5) 准备一个 T-25 培养瓶，写上细胞名称、日期，再加入 4ml 完全培养基；
6) 离心完成后弃去上清，用 1ml 完全培养基重悬细胞后，转入 T-25 细胞培养中，混匀后转入 CO2 培养箱中培养静置。
注意：从液氮中取出细胞冻存管时，若冻存管内有液氮进入，需拧松冻存管，排出内部残留的液氮，之后拧紧冻存管，置于干冰上，然后放入 37℃水浴中，避免温差太大造成液氮快速气化而爆炸。
传代
（传代比例：1 个 T25 瓶传 2 个 6cm 的培养皿或者 2 个 T25 瓶 相当于 1:2 1 个 T25 瓶传 1 个 10cm 的培养皿或者 1 个 T75 瓶 相当于 1:3）
贴壁细胞：
1) 当细胞汇合度达到 80%-90%时，可进行传代。
2) 在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，收集瓶内的培养基；
3) 向培养瓶内加入 3ml 无菌的 1×PBS 后，水平放置培养瓶，使 PBS 能够浸润到培养瓶底面上所有的面积，吸弃 PBS，对于分泌物比较多的细胞可以重复 2-3 次。也可以轻轻的冲洗；
4) 向瓶内加入消化液 1ml ，浸润底面后放入 37℃ CO2 培养箱中孵育 1~2min（当胰酶加入后培养箱内30 秒后细胞开始逐步脱落，过程中可以移出培养箱至显微镜下观察后续细胞变圆脱落情况，当 90%细胞都脱落后立马终止消化，剩下的 10%左右的细胞可以单独处理完，换液继续培养有可能也可以生长起来）（注意：消化时间与所用胰酶效价、消化时候细胞密度、细胞贴壁强弱以及温度等因素有关，建议第一次消化时候，多在显微镜下观察，以找到最佳消化时间。）
5) 孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若绝大多数消化下来则直接向培养瓶内加入 3ml 含 10%FBS 的完全培养基中，将悬液吸入 15ml离心管；一定要彻底终止消化，以防含有 EDTA 的胰酶残留，会损伤刺激细胞膜。在以消化下来为前提的情况下，减少胰酶对细胞膜的损伤时间，有助于维持细胞系的状态持续稳定，降低老化速度）
6) 1000rpm 离心 5min；
7) 准备两个新的 T-25 培养瓶，各加入 4ml 完全培养基。
8) 离心完成后，弃上清，用 2ml 完全培养基重悬离心细胞，将重悬后的细胞转入 2 个 T-25 培养瓶，每个培养瓶各 1ml；
9) 水平放置培养瓶，震荡混匀后，将培养瓶置于 37℃, 5%CO2 培养箱中静置培养。
注意：贴壁细胞消化过程对于控制细胞的老化最为关键，原则在于达到消化的目的同时，减少细胞被胰酶刺激的时长。
a) 每次消化不超过 2min，如果消化 2min 后，培养瓶中还有较多细胞贴壁，可采用分步消化，将消化下来的细胞移入 15mL 离心管中和，再向培养瓶中加入胰酶继续消化，每次消化不超过 2min ，直到完全消化下来为止。
b) 细胞传代建议 1 传 2，前期传代后冻存一份细胞，另外一份细胞继续扩增，确保细胞种子保留好之后可以扩大传代比例。
c) 特殊细胞贴壁特别牢固的也可以采用长时间消化法或者物理细胞铲（刮）把细胞消化或者刮下来，比如巨噬类细胞。
d) 有一些细胞属于半贴壁生长，收货后一部分贴壁，还有一部分悬浮的情况下，注意不要把悬浮的细胞全部抽掉不要，或许还是活细胞，应该根据密度数量情况决定是否需要收集起来和贴壁一重新铺瓶。
悬浮细胞：悬浮细胞尤其是很多血液类相关细胞比较容易受环境运输影响出现更多比例的死细胞，收货后尽快收集全部细胞重新铺瓶，可以采用 T25瓶竖着培养 5ml 完全培养基降低培养基容量提高初始密度尽量高一点，该换液的时候进行补液 2-3ml 进去的方式减少细胞丢失，避免反复离心。
冻存（细胞冻存建议每瓶 T25 冻一支）
1) 将需要那冻存的细胞从 CO2 培养箱中取出，在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，吸弃瓶内的培养基；
2) 向培养内加入无菌 1×PBS 3ml，之后水平放置培养瓶，旋转震荡培养瓶，使 PBS 能够浸润到培养平面上所都的面积，吸弃 PBS；
3) 重复步骤 2一次，之后向瓶内加入消化液 2ml，轻微震荡后放入 37℃ CO2 培养箱中孵育 1min 左右；
4) 孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，如还有部分细胞未消化下来，可在生物安全柜内用移液管吸起消化液，吹打培养平面；
5) 向消化下细胞的培养瓶中加入 3ml 含 10%血清的完全培养基终止消化，然后将培养瓶中的液体转入 15ml 离心管中，300g 离心5min；
6) 离心完成后，弃上清，用 1mL 冻存液重悬细胞沉淀，然后转入 1.8ml 冻存管中；
7) 将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；
8) 第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。
列：LOVO 人结肠癌细胞
种属：人源
生长特性：贴壁上皮样
注意事项：
1. 本产品仅限用于科学研究，不可用于人和动物的活体诊断治疗。
2. 所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作。
3. 充液培养基血清浓度为2%，请勿使用原瓶培养基培养，需更换新鲜培养基。
验收产品：
1. 请检查包装是否有破损或漏液情况。
2. 使用75%酒精喷洒消毒培养瓶后镜检细胞状态。
3. 如为冻存细胞，请立即放至-80℃超低温冰箱或液氮或立刻进行复苏培养操作。
培养条件：
LOVO ： 90%F-12K+10%FBS（货号：FBS-AS500）
温度：37℃ 气相：95%空气，5%二氧化碳
冻存条件：SERANA 无血清细胞冻存液 （货号：WXQA100）
传代方式：
1. 细胞密度达80% ~ 90%以上，可以进行传代，传代比例为1:2到1:5。
2. 弃去原培养基，加入3-5 ml PBS，轻晃洗涤后弃去。
3. 加入1~2mL消化液，置于37°C孵育消化。
（第一次消化时常取出于显微镜下观察，以显微镜下细胞触角回收变圆、轻拍瓶壁见细胞脱落为最佳消化时间，记录最佳消化时间，以便于下次消化）
4. 消化好后加入3ml完全培养基，将悬液轻轻打匀后转移至15mL离心管。
5. 1200rpm离心3min，弃上清，加入完全培养基重悬细胞，进行传代。
冻存方式：
细胞冻存步骤以SERANA 无血清细胞冻存液为例：
1. 细胞冻存时，弃去原培养基，加入2mL PBS，润洗后去除。
2. 加入1mL 0.25%胰酶-EDTA消化液，置于37°C孵育，细胞皱缩变圆开始脱落时终止消化，加入3mL完全培养基。
3. 将悬液轻轻吹匀后转移至15mL离心管，1200r/min离心3min。
4. 去上清，按大约1*10^6个细胞/mL加入预冷4℃的无血清冻存液。
5. 吹打均匀，每支冻存管冻存1mL细胞液，注意冻存管做好标识。
6. 将冻存管置于-80℃冰箱，过夜后转移至液氮中保存。
复苏细胞：
1. 将冻存管在37°C水浴中迅速摇晃解冻。
2. 移至离心管，滴加3mL预热后培养基。
3. 1000r/min离心5min，去上清，加入1mL完全培养基。
4. 吹打成单细胞悬液，加入培养瓶。
5. 补足完全培养基至5mL，十字交叉法摇晃培养瓶使细胞分布均匀。
6. 置于37°C培养箱培养静置。