BiomimX肺器官芯片用于模拟和研究柴油颗粒物诱导的肺泡损伤

一、实验目的

利用BiomimX uBeat® Stretch器官芯片平台，构建肺泡-毛细血管屏障模型，在气-液界面（ALI）及呼吸模拟机械拉伸条件下，评估柴油颗粒物（DPM）诱导的肺泡上皮-内皮跨屏障损伤，并验证磷酸二酯酶-4（PDE4）抑制剂 roflumilast-N-oxide（RNO）的干预效果。

二、实验材料

类别	材料/设备	来源/型号
器官芯片平台	BiomimX uBeat® Stretch10（10% 单轴拉伸平台）	BiomimX Srl, Italy
机械刺激控制器	uBoX Pro  气动控制器	BiomimX Srl, Italy
细胞	人原代肺泡上皮细胞（HPAECs）	Cell Biologics
	人肺微血管内皮细胞（HMVECs）	Lonza
培养基	内皮细胞生长培养基 EGM-2	Lonza (CC-3202)
检测试剂	Live/Dead 细胞活性检测试剂盒	Biotium
	FITC-葡聚糖（4 kDa）	Sigma-Aldrich
	γ-H2AX 抗体、ZO-1 抗体、VE-cadherin 抗体	Cell Signaling Technology / Rockland
暴露材料	柴油颗粒物（DPM）	标准参照物
药物	Roflumilast-N-oxide（RNO）	MedChemExpress (HY-100639)

三、实验方法

3.1  细胞接种与液-液界面共培养

内皮细胞接种：将 HMVECs 以2 × 10⁵ cells/cm²密度接种于膜基底侧（basolateral）。静置 4 h 使细胞贴附。

上皮细胞接种：将 HPAECs 以5 × 10⁵ cells/cm²密度接种于膜顶侧（apical）。

液-液共培养：两侧均加入 EGM-2 培养基，37 °C、5% CO₂ 培养7 d，每日观察细胞汇合度，每 2 d 换液，促进屏障形成。

---

3.2 ALI 培养与呼吸模拟机械拉伸

ALI 建立：培养第 7 d，移除顶侧培养基，仅保留基底侧培养基，建立气-液界面（ALI）培养。继续培养 24 h 使细胞适应。

呼吸模拟参数设置：通过uBoX Pro控制器设定机械拉伸程序

• 拉伸模式：单轴循环拉伸（Uniaxial Cyclic Stretch）

• 拉伸幅度：10%（对应 uBeat® Stretch平台满量程）

• 频率：0.33 Hz（~20 次/min，模拟静息呼吸频率）

• 占空比：1:1（拉伸/松弛时间相等）

• 刺激时长：自 ALI 建立后持续施加，贯穿整个暴露与检测期。

   

平台优势：BiomimX  uBeat® Stretch 的专利气动驱动确保膜面应变均匀，避免局部应力集中；三个独立腔室可同步运行对照、DPM 暴露、DPM+RNO 干预三组实验。

3.3 DPM 暴露与 RNO 干预

DPM 制备：DPM 分散于去离子水，超声处理 5 min；动态光散射（DLS）与激光衍射确认粒径分布（0.1–10 μm）。

顶侧暴露：ALI 培养第 8 d，使用北京基尔比气溶胶雾化发生器将 DPM 悬液雾化并施加于顶侧腔室，设定暴露剂量：0、30、60 μg/cm²。

RNO 干预：DPM 暴露同时，向基底侧腔室加入含RNO（100 nM）的 EGM-2 培养基。

暴露时间：24 h

---

3.4终点检测

检测项目	方法	样本/位置
细胞活性	Live/Dead 荧光染色（Calcein AM / EthD-III）	上皮侧 + 基底侧
屏障完整性	FITC-葡聚糖（4 kDa）表观渗透系数（Papp）	跨膜转运
紧密/粘附连接	免疫荧光：ZO-1（上皮）、VE-cadherin（内皮）	膜两侧
氧化应激	过氧化氢（H₂O₂）定量试剂盒	基底侧培养基
DNA 损伤	γ-H2AX 免疫荧光 + DAPI 核染	上皮 + 内皮
炎症因子	多重细胞因子 ELISA（IL-6、IL-8、MCP-1、GM-CSF）	基底侧培养基

---

四、结果与小结

屏障功能：HPAECs/HMVECs 在芯片膜上形成致密单层，ZO-1 与 VE-cadherin 阳性；Papp 低于 Transwell® 对照，机械拉伸适度增加通透性。

DPM 毒性：剂量依赖性降低上皮/内皮细胞活性，增加跨膜通透性、H₂O₂ 水平及 γ-H2AX 阳性率，证实跨屏障损伤传播。

RNO 效应：显著降低 ROS 与促炎因子分泌，但对细胞活性及屏障通透性恢复作用有限，提示其选择性抗炎机制。

传统模型难以区分颗粒物肺损伤的多维终点。BiomimX器官芯片平台通过动态拉伸，分层解析细胞毒性、屏障通透性与炎症反应，揭示了DPM跨屏障损伤传播及PDE4抑制剂RNO"抗炎与屏障修复解耦"的作用特征。

 

传统整体动物实验仅凭炎症指标可能高估药物的屏障保护效能。该平台为颗粒物毒性机制与干预策略评估提供了高生理相关性的体外工具。

 

未来可整合免疫细胞并转向低剂量长期暴露，以模拟慢性空气污染场景。当前局限在于急性高剂量与真实环境暴露的差异，以及颗粒跨屏障转运途径（穿细胞vs.旁细胞）尚待高分辨示踪阐明

附：

北 京 基 尔 比 生物 科技公司 主营产品：

AnimFree 体外类器官气溶胶暴露染毒装置

Kirkstall 3D细胞类器官串联式自动灌流系统，

BiomimX uBeat®多功能动态器官芯片系统

Kilby Gravity 微重力旋转细胞类器官培养系统RCCS，

动植物/微生物等地面重力环境模拟装置【可以定制】，

Kilby Bio 高通量类器官精密摇摆仪