【解答】为什么心肌细胞（iPS-CM）培养需要用到品牌制造商北京基尔比细胞微重力回转仪？

‌Kilby Gravity是北京基尔比生物科技公司研发的微重力培养系统，主要用于模拟太空微重力环境，研究细胞和组织在低剪切力条件下的生长特性‌。该系统通过三维旋转技术创造接近太空的微重力环境，支持类器官、细胞聚集体等三维结构的形成，并广泛应用于航天医学、慢性伤口修复等研究领域。

（一）人 iPSC → 心肌细胞（iPS-CM）详细分化流程

预处理阶段（Day −3 ~ Day 0）

使用 Essential 8™ Flex 培养基（Thermo A2858501），每日换液。维持细胞高密度（约 100 % 融合度）至 Day 0，确保未分化状态良好。

Day 0：微消化 + 启动分化

• 吸去旧培养基，用 1 mL D-PBS 冲洗一次。
• 加入 1 mL 0.5 mM EDTA/D-PBS，37 °C 孵育 35 秒，轻叩培养板使约 10 % 细胞脱落。
• 吸去 EDTA 溶液，直接加入 2 mL 分化培养基：
• RPMI 1640 + B27 minus insulin（A1895601）
• 6 µM CHIR99021（GSK-3β 抑制剂）
• 10 ng/mL Activin A
• 0 µg/mL 抗坏血酸（Sigma A4544）
• 不换液，细胞保持小簇状态。

Day 1：换液（清除诱导因子）

吸去旧培养基，加入 2 mL 新鲜 RPMI 1640 + B27 minus insulin（不含 CHIR/Activin/Ascorbic）。

Day 2：第二脉冲（Wnt 抑制）

换液为 2 mL RPMI 1640 + B27 minus insulin + 10 µM IWR-1（Wnt 抑制剂，Tocrin 3532）。

Day 4：继续 Wnt 抑制

同上，换液为 2 mL RPMI 1640 + B27 minus insulin + 10 µM IWR-1。

Day 6：撤 IWR-1

换液为 2 mL RPMI 1640 + B27 minus insulin（不含 IWR-1）。

Day 8：转入维持培养

换液为 2 mL 心肌维持培养基：RPMI 1640 + B27 plus insulin（A1895602）。每 2 天换液一次。

Day 9~10：观察跳动

出现自发搏动细胞簇，跳动面积 ≥20 % 视为分化成功。

Day 11：乳酸纯化（选择性存活）

换液为 无葡萄糖 RPMI 1640 + B27 plus insulin + 4 mM 乳酸钠（Sigma L7022）。持续 72 小时（至 Day 14），非心肌细胞逐渐死亡。

Day 14：恢复正常培养

换回心肌维持培养基（含葡萄糖），每 2 天换液。此时可获得 ≥70 % 纯度的 iPS-CM，可用于后续实验。

单细胞传代（可选，Day 11–14）

• 0.25 % Trypsin-EDTA 37 °C 消化 3–4 分钟。
• 加入 10 µM Y-27632（ROCK 抑制剂）保护细胞，1:6–1:12 分盘。
• 重新贴壁后继续心肌维持培养基培养。

成熟时间点

• Day 14：cTnT⁺/NKX2.5⁺ ≥70 %（流式鉴定）。
• Day 21–30：动作电位、钙瞬变、脂肪酸氧化能力成熟，可用于代谢、电生理、药物毒性等实验。

成熟鉴定时间点

• Day 14：cTnT⁺/NKX2.5⁺ 比例 ≥70 %（流式）。
• Day 21–28：动作电位、钙瞬变、脂肪酸氧化能力接近成人心肌。
• ≥Day 30：可进行代谢通量、电生理、药物毒性测试。

关键质量控制

1. 起始 iPSC 核型正常、支原体阴性。
2. Day 0 微消化后细胞密度 60–70 % 最佳，过密易分化失败。
3. CHIR99021 批次差异大，每批需预实验测毒性/活性曲线（4–8 µM 范围内）。
4. 乳酸纯化阶段若出现大量漂浮细胞，可提前终止（48 h）。
5. 长期培养 ≥Day 30 需改用 20 % FBS 的心肌维持培养基，防止细胞变薄脱壁。

依据上述流程，通常 14 天可获得 ≥70 % 纯度、自发搏动的 iPS-CM；30 天达到功能成熟，可直接用于后续代谢表征、电生理或 微 重 力 实验。

（二）微重力对心肌细胞分化的正向影响

研究

关键发现

机制提示

Rampoldi 等（2023）、Hwang 等（2023）

短期（≤10 天）空间微重力显著上调心肌发育、收缩、钙通道等 GO 项，提升心肌细胞比例和增殖率。

RNAseq 显示心肌特异基因（NKX2.5、αactinin、cTnT）表达提升；细胞周期基因（CCND2）上调。

Wang 等（2024）

3 天模拟微重力 + 3D 球体培养，使心肌细胞纯度达到 99 %，产率比常规 1g 条件高 1.54 倍。

早期增殖/存活基因（YAP1、RELN）上调，细胞凋亡基因下调。

Forghani 等（2024）

14 天和 28 天培养中，SMG 组 NKX2.5、αactinin 阳性率显著高于对照，形态更成熟。

细胞骨架重排、细胞间黏附增强。

Fuentes 等（2015）

对成年心脏前体细胞（CPC）在模拟微重力下，心肌标记基因（troponin T、MLC2v）表达上升；对新生儿 CPC 则出现去分化特征（miR99/100 下调、Oct4、MESP1 上调）。

微重力诱导的年龄依赖性表观遗传调控。

Bhatt 等（2024）、Han 等（2024）

微重力提升iPSCCM 中 YAP1、CCND2、RELN 等再生相关基因表达，改善细胞存活与再生潜能。

机械感知通路（HippoYAP）激活。

总体结论：在短期或适度的微重力刺激下，心肌前体细胞的增殖与分化效率普遍提升，关键心肌转录因子和结构蛋白表达上调，细胞死亡与炎症信号被抑制。

Kilby类器官与器官芯片

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（三）微重力可能的负向或抑制效应

研究

关键发现

说明

Huang 等（2009）

模拟微重力（SMG）抑制大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSC）向心肌细胞的分化（cTnT、βMHC、GATA4 表达下降）。

可能与细胞骨架张力降低、细胞黏附受损有关。

ELGRA 报告（2007）

微重力导致成熟心肌细胞（HL1）出现细胞骨架重排、黏附下降和凋亡增加；但心脏干细胞（CSC）在恢复重力后可重新增殖。

表明已分化的心肌细胞对微重力更敏感，干细胞具有一定恢复能力。

解释：负向效应多出现在已分化或成熟的心肌细胞、或在长期（>2 周）持续微重力暴露后。细胞类型、培养基、重力强度和暴露时间是决定效应方向的关键因素。

友 情 通 知：

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