三维3D细胞培养评估多种霉菌毒素复合暴露

 

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（一）研究背景

霉菌毒素问题：人类通过饮食同时暴露于多种霉菌毒素（如STE、OTA、PAT），但现有风险评估多基于单一毒素，可能低估实际风险。

研究目的：填补联合暴露的评估空白，评估STE、OTA、PAT三种霉菌毒素单独及联合暴露的毒性，并分析其相互作用。

（二）研究方法

模型：使用三维（3D）球体培养的人类神经母细胞瘤（SH-SY5Y）和健康骨髓间充质干细胞（BM-MSCs），更接近生理状态。

毒素浓度：基于文献和膳食暴露数据，设定STE（1.56–50μM）、OTA（0.78–25μM）、PAT（0.15–5μM）的浓度范围。

实验设计：单独及联合暴露（二元组合：STE+OTA、STE+PAT、OTA+PAT；三元组合：STE+OTA+PAT）72小时。

评估方法：

- 细胞毒性：ATP法测定细胞活力，计算IC50值。

- 相互作用分析：使用等效线图（isobologram）和联合指数（CI）判断协同（CI<1）、相加（CI≈1）或拮抗（CI>1）效应。

（三）研究步骤

3-I、模型选择与构建

1. 细胞来源

• 肿瘤细胞：SH-SY5Y 人神经母细胞瘤细胞系（ATCC CRL-2266）。

• 健康细胞：BM-MSCs 人骨髓间充质干细胞（ATCC PCS-500-012），≤P9 代以内，以尽量维持干性。

2. 3D 球体制备流程

① 单层扩增 → ② 酶消化成单细胞悬液 → ③ 计数并调整密度 → ④ 接种到超低吸附（ULA）96 孔圆底板 → ⑤ 48 h 自聚集形成均一直径（≈250–300 µm）球体 → ⑥ 每 2–3 d 半量换液，保持微环境稳态。

3. 培养基配方

• SH-SY5Y：高糖 DMEM + 10 % FBS + 1 % NEAA + 1 % P/S。

• BM-MSCs：MSC 专用基础培养基 + 7 % FBS + 2.4 mM L-alanyl-L-glutamine + 125 pg/mL rhFGF-b + 15 ng/mL rhIGF-1 + 0.5 % P/S。

3-II、3D 球体的生理相关性

1. 结构特征

• 模拟体内微组织：外层增殖区、中层静止区、核心低氧/坏死区，形成氧气/养分/代谢物梯度。

• 细胞-细胞与细胞-基质相互作用恢复：E-cadherin、整合素信号、细胞极性等与体内组织相似。

2. 功能特征

• 代谢酶与转运体活性增强：如 CYP450、ABC 转运蛋白表达水平显著高于 2D，药物外排/代谢更接近人体。

• 基因表达谱变化：上调细胞外基质（COL1A1、FN1）、干细胞干性（SOX2、OCT4）及神经分化相关基因。

3. 与 2D 的差异

3-III、毒理学评价方法

1. 终点检测

• 细胞活力：CellTiter-Glo® 3D ATP 发光法，可穿透球体核心，保证全球体均一裂解。

• 高内涵成像（可选）：PI/Calcein-AM 双染，验证坏死/凋亡空间分布。

2. 数据处理

• 浓度-反应曲线：非线性回归（log[inhibitor] vs. normalized response）计算 IC50。

• 三维重现性：独立实验 ≥3 次，每实验 3–4 复孔，确保 SEM <10 %。

3-IV、为什么选择 3D 而非动物模型

1. 伦理与 3R 原则：减少（Reduce）、优化（Refine）、替代（Replace）。

2. 通量与成本：96 孔平台，一次可同时检测数十种浓度组合，成本 <1/10 小鼠实验。

3. 人源化：直接使用人细胞，避免种属差异。

4. 剂量设计：依据欧洲膳食摄入估计值（谷物 222.5 g/d，水果 139 g/d）将体内 nM–µM 摄入量换算到 72 h 体外暴露系统，确保环境相关。

5. 组合毒性：球体模型能探测到 2D 难以发现的低剂量协同效应，如 STE+OTA+PAT 在 0.46 µM 即表现出明显毒性（CI≈0.46）。

（四）研究结论

联合毒性：STE、OTA、PAT联合暴露时毒性增强，提示实际风险可能高于单一毒素评估结果。

模型优势：3D球体模型提高了结果的生理相关性，为制定霉菌毒素混合物的监管标准提供了科学依据。

政策建议：需重新评估现有安全限值，考虑联合暴露风险，尤其在食品中多种霉菌毒素共存的情况下。

（五）研究意义

该研究利用 3D 球体模型在结构、代谢、基因表达层面高度模拟体内微组织，为霉菌毒素联合暴露的毒性评估提供了高生理相关性、高通量、低伦理负担的先进平台，其结果更能真实反映人类膳食暴露风险，并为后续监管决策提供坚实数据基础。

首次系统评估STE、OTA、PAT联合毒性，为霉菌毒素混合物的风险评估和监管政策提供重要参考，推动从单一毒素向多毒素联合评估的转变。

局 限 与 展 望

1. 缺乏血管化：今后可引入微流控芯片或共培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC），构建“血管化球体”。

2. 免疫组分缺失：可整合巨噬细胞或外周血单核细胞（PBMC）形成免疫-肿瘤-毒素三向相互作用模型。

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