包含卵巢癌细胞与成纤维细胞的3D共培养模型——北京基尔比生物公司概述

59 人阅读发布时间：2025-08-08 12:51

卵巢癌是全球女性癌症死亡第五大原因，晚期诊断导致预后差。

肿瘤微环境（TME）在卵巢癌进展中起关键作用，尤其癌症相关成纤维细胞（CAFs）。传统2D模型无法有效模拟TME，3D球状体模型更接近体内肿瘤结构。

（一）研究目的

开发并表征一种包含卵巢癌细胞与成纤维细胞的3D共培养球状体模型，以更真实地模拟肿瘤微环境，用于研究肿瘤行为及药物反应。

（二）3D共培养卵巢癌-成纤维球状体模型构建步骤

阶段	步骤序号	操作内容	技术细节与参数
1. 细胞准备	1.1	复苏与培养	OvCar8、A2780、UF-403 用 DMEM+10 % FBS+1 % P/S；Detroit 551 与 UF-403 成纤维细胞用 DMEM+20 % FBS+1 % P/S+ITS+0.1 µM Dex,每 2–3 天换液，维持对数期
	1.2	STR 鉴定 & 支原体检测	通过 STR 16 位点确认身份；MycoAlert 试剂盒，阴性方可进入实验
	1.3	荧光预标记	癌细胞：CellTracker Deep Red（OvCar8 2 µM；A2780 5 µM；UF-403 1 µM，1 h）；成纤维细胞：CellTracker Green CMFDA（按说明书）
2. 细胞计数与混合	2.1	单细胞悬液制备	0.25 % Trypsin-EDTA 消化，中和后离心 300 × g 3 min
	2.2	按比例混合	① OvCar8 : 成纤维 = 2 : 1；② A2780 : 成纤维 = 1 : 1；③ UF-403 : 成纤维 = 2 : 1；总细胞数 12 000/孔（OvCar8）、2 500/孔（A2780）
3. 球状体形成	3.1	接种	96 孔超低附着板 (ULA, Corning 4520)；每孔 100 µL 混合悬液
	3.2	离心促聚集	300 × g 3 min
	3.3	培养	37 °C、5 % CO₂，96 h；每日 4× 镜检记录
4. 生长监测	4.1	明场成像	0 h、24 h、48 h、72 h、96 h 时间点
	4.2	计算生长动力学	软件自动输出面积 vs 时间曲线
5. 结构表征	5.1	扫描电镜 (SEM)	2.5 % 戊二醛固定 1 h → 1 % 锇酸后固定 1.5 h → 梯度乙醇脱水 → HMDS 干燥 → 金溅射
	5.2	激光共聚焦 (LSM)	4 % PFA 固定 1 h → 0.5 M 甘氨酸 → 0.2 % Triton + 20 % DMSO 透化 → Hoechst 33342 核染 → 88 % 甘油透明
	5.3	免疫组化 (IHC)	琼脂预包埋→ 石蜡切片 4 µm → Ki-67、PAX8、FAP 抗体 → Bond RX 自动染色
6. 功能实验	6.1	药物处理	72 h 换 50 % 新鲜培养基 → 加入 100 µM 顺铂或 PBS；继续 24 h
	6.2	细胞毒性测定	CellTox Green（1 : 2 000）染色 24 h → NYONE 定量荧光
	6.3	凋亡检测	RealTime-Glo + Caspase-Glo 3/7 双荧光素酶法
	6.4	活/死染色	Calcein-AM (活细胞绿) + PI (死细胞红) + Hoechst 33342
7. 顺序接种（可选）	7.1	延迟 24 h 接种	① 先成纤维后癌；② 先癌后成纤维；其余步骤同 3.1–3.3
8. 数据与统计	8.1	图像分析	NYONE、ZEN 3.5、Keyence 软件分别处理明场、共聚焦、荧光
	8.2	统计分析	GraphPad Prism 10.2.2；单因素 ANOVA + Dunnett 或 t-test