基尔比生物介绍脑类器官与T细胞3D共培养，研究帕金森病相关免疫-神经相互作用

 

帕金森病（PD）的神经变性与外周免疫细胞（尤其是 T 细胞）浸润中枢神经系统（CNS）及其与脑内细胞的相互作用密切相关，但 T 细胞与脑细胞的具体作用机制尚未明确。

构建一种由人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的中脑类器官（hMO）与外周血 T 细胞组成的 3D 共培养模型，旨在模拟 T 细胞与中脑组织的空间相互作用，为研究 PD 相关免疫 - 神经相互作用提供工具。

第一章：经典回顾

（一）人中脑类器官（hMO）的生成与分化：hMO 由健康供体成纤维细胞重编程为 hiPSC 后诱导分化而来

• hiPSC 制备
• 健康供体成纤维细胞通过逆转录病毒转导 OCT3/4、c-MYC、SOX2、KLF4 四因子重编程为 hiPSC，筛选 TRA1-60 阳性率 > 95% 的细胞系。
• 分阶段分化（30 天 / 60 天）

1. 神经诱导阶段（第 0-4 天）
2. hiPSC 单细胞接种于低吸附 U 型 96 孔板，使用神经诱导培养基（DMEM/F12:Neurobasal=1:1，添加 N2、B27（无维生素 A）、GlutaMAX、非必需氨基酸、β- 巯基乙醇、肝素、10μM SB431542、200ng/ml Noggin、0.8μM CHIR99021），并加入 10μM ROCK 抑制剂 Y27632（前 48 小时），2 天更换一次培养基。
3. 中脑模式化阶段（第 4-7 天）
4. 加入 100ng/ml SHH-C25II 和 100ng/ml FGF8，诱导神经外胚层芽形成。
5. 组织生长阶段（第 7 天后）
6. 将类器官嵌入 20μL Matrigel，使用组织生长诱导培养基（含 Neurobasal、N2、B27、胰岛素、层粘连蛋白、SHH-C25II、FGF8）培养 24 小时；随后转移至超低吸附 6 孔板，使用终分化培养基（含 BDNF、GDNF、抗坏血酸、db-cAMP），置于摇床上培养（促进营养交换），每 2 天换液，持续至 30 天或 60 天。

（二）外周血 T 细胞的分离与激活

分离：健康供体外周血单个核细胞（PBMC）中，通过 Pan T 细胞分离试剂盒（磁珠阴性选择法）分离 T 细胞，培养于含 10% 热灭活胎牛血清（FCS）的 RPMI 培养基中。

激活：使用 CD3/CD28 磁珠体外激活 T 细胞 48 小时（通过抗 CD3 和 CD28 抗体分别触发 T 细胞受体和共刺激分子），激活后涡旋 1 分钟去除磁珠，用于后续共培养。

（三）共培养实验步骤（核心部分）

1. 共培养条件优化：通过测试 4 种培养基（hMOM、hMOM+IL-2、SFLM、SFLM+IL-2），评估 hMO 存活率和 T 细胞活性，确定最佳条件

• hMOM（中脑类器官培养基）
• 支持 hMO 存活的基础培养基（含 Neurobasal、N2、B27、BDNF、GDNF 等）。
• IL-2 补充
• 25U/ml IL-2 可维持 T 细胞存活与激活（流式细胞术显示 CD25 + 激活 T 细胞比例更高，存活率提升）。
• 最终选择
• hMOM+IL-2 为最优共培养培养基（同时支持 hMO 存活和 T 细胞活性）。

2. 共培养操作流程

• 细胞准备
• hMO：选择 30 天龄（1 个月）或 60 天龄（2 个月）的 hMO（分别模拟不同成熟阶段）。
• T 细胞：使用激活后的 T 细胞（CD3+CD25 + 比例约 100%）。
• 接种比例
• 每孔 2 个 hMO 对应 100 万 T 细胞（参考 PD 患者死后中脑组织中 T 细胞与神经细胞比例）。
• 培养条件
• 24 孔板中加入 2ml hMOM+IL-2 培养基，放入 hMO 和 T 细胞。
• 37°C、5% CO₂培养箱中，置于摇床上培养 7 天（促进细胞接触和营养交换），每 2 天更换一次培养基。

3. 共培养后分析方法

• T 细胞浸润检测
• 通过免疫细胞化学（ICC）染色 CD3 + 细胞，定量 hMO 中 T 细胞比例（流式细胞术或 ImageJ 计数）。
• 神经细胞损伤评估
• TUNEL 染色检测细胞凋亡（定量 TUNEL + 细胞比例）。
• MAP2 免疫荧光染色（神经元标志物），通过平均荧光强度（MFI）评估神经元丢失。
• T 细胞表型分析
• 流式细胞术检测浸润 T 细胞的亚型（CD4+/CD8 + 比例）、细胞毒性分子（CD107a、颗粒酶 B）及细胞因子（IFN-γ、IL-17、TNF-α 等）。

（四）本文研究的主要结果

1. T 细胞浸润与神经损伤
2. 激活的 T 细胞可浸润 hMO，且 60 天龄 hMO 浸润更多（年龄依赖性）；T 细胞浸润导致 hMO 中 MAP2 + 神经元减少，TUNEL + 凋亡细胞增加（与 T 细胞比例呈正相关）。
3. 脑区特异性
4. 与大脑皮质类器官（hCO）相比，hMO 对 T 细胞浸润更敏感，且 T 细胞介导的神经损伤更显著（符合 PD 中中脑易损性特征）。
5. 机制提示
6. 浸润的 T 细胞高表达 LFA-1 和 VLA-4 整合素（与 hMO 中的 ICAM-1、VCAM-1 配体结合），且 CD8+ T 细胞分泌颗粒酶 B 等细胞毒性分子，CD4+ T 细胞分泌促炎细胞因子，共同介导神经损伤。

上述3D 共培养模型可模拟 T 细胞与中脑组织的空间相互作用，揭示了 T 细胞浸润的年龄依赖性（老年 hMO 更敏感）和脑区特异性（中脑比皮质更易受损），为研究 PD 中免疫介导的神经变性机制及潜在治疗靶点提供了新工具。

第二章：用于T细胞和中脑类器官共培养的其他研究方法

除了第一章节文中提到的 3D 直接共培养方法（hMO 与 T 细胞在 hMOM+IL-2 培养基中混合培养），针对 T 细胞与中脑类器官的共培养研究，还有多种方法可从系统结构、细胞互作模式、环境模拟等角度优化或扩展

从微环境模拟（如Kirkstall Quasi Vivo微流控类器官串联芯片、支架）、细胞互作模式（间接共培养、多细胞协同）、病理相关性（疾病特异性模型）和动态监测（实时成像）等角度扩展了共培养体系，可根据研究目标（如机制探索、药物筛选）选择适配的方法。例如，微流控模型适合研究 T 细胞迁移的分子机制，Kirkstall Quasi Vivo多细胞串联共培养模型更适合解析免疫网络对神经变性的调控。

一、微流控芯片共培养系统

原理与设计

利用微流控技术构建仿生微环境，通过微通道分隔或连接类器官与 T 细胞区域，精准控制细胞接触方式、营养梯度和可溶性因子交换，模拟体内血流动力学和组织微环境。

操作要点

• 芯片结构
• 设计双腔室或多通道芯片，一侧接种中脑类器官（hMO），另一侧接种 T 细胞，通过微米级通道连接（通道孔径可调节，控制细胞迁移能力）。
• 流体控制
• 采用 syringe pump 维持培养基低速流动（如 1-5 μL/min），模拟脑内组织液循环，确保营养和代谢物交换，同时避免剪切力损伤细胞。
• 优势
• 可实时观察 T 细胞定向迁移（通过通道进入 hMO 区域）的动态过程；精准调控细胞因子（如趋化因子 CXCL12）的浓度梯度，研究其对 T 细胞浸润的影响；避免传统静态培养中代谢物积累的问题，延长共培养时间（可至 2-4 周）。

二、间接共培养模型（非接触式）

原理

通过物理屏障（如 Transwell 小室）分离 hMO 与 T 细胞，仅允许可溶性因子（细胞因子、趋化因子等）通过，研究 T 细胞通过 “旁分泌作用” 而非直接接触对中脑组织的影响。

操作要点

• Transwell 设置
• 将 hMO 接种于下室（6 孔板），T 细胞接种于上室（0.4 μm 孔径的 Transwell 插入式小室，允许小分子通过但阻止细胞迁移）。
• 培养基
• 使用文中优化的 hMOM+IL-2 培养基，确保上下室营养一致。
• 检测指标
• 下室 hMO 的神经元存活（MAP2 表达）和凋亡（TUNEL）；上室 T 细胞分泌的细胞因子（如 IFN-γ、TNF-α）水平（通过 ELISA 或流式细胞术检测）；对比直接共培养结果，区分 “T 细胞直接接触损伤” 与 “细胞因子介导的间接损伤”。

三、多细胞共培养模型（引入脑内常驻细胞）

1. 加入小胶质细胞（脑内常驻免疫细胞）

原理

小胶质细胞是脑内免疫调节的核心细胞，可与 T 细胞相互作用（如呈递抗原、分泌细胞因子），共同影响神经元存活。该模型更接近体内 “T 细胞 - 小胶质细胞 - 神经元” 的复杂互作网络。

操作要点

• 小胶质细胞来源
• 从 hiPSC 诱导分化为小胶质细胞（通过添加 CSF1、IL-34 等因子），或使用原代小胶质细胞。
• 共培养步骤

1. 先将小胶质细胞与 hMO 共培养 3 天（让其整合入类器官）；
2. 再加入激活的 T 细胞，使用 hMOM+IL-2 培养基，置于摇床上培养 7 天。

• 优势
• 研究小胶质细胞是否通过 “吞噬 T 细胞释放的颗粒酶” 或 “分泌抗炎因子（如 IL-10）” 调节神经损伤，解释免疫细胞间的协同或拮抗作用。

2. 引入血管内皮细胞（模拟血脑屏障）

原理

血脑屏障（BBB）破坏是 T 细胞浸润脑内的前提，通过在 hMO 表面构建内皮细胞层（模拟 BBB），研究 T 细胞如何突破屏障进入中脑组织。

操作要点

• BBB 模拟
• 在 hMO 表面接种人脑微血管内皮细胞（HBMEC），培养 5-7 天形成紧密连接（通过检测 ZO-1、Claudin-5 等紧密连接蛋白验证）。
• 共培养
• 将 T 细胞接种于内皮细胞层外侧，观察其是否通过 “破坏紧密连接” 或 “跨内皮迁移” 进入 hMO，通过电镜或免疫荧光检测内皮屏障完整性（如 permeability 实验）。

四、3D 支架辅助共培养

原理

使用生物相容性支架（如明胶、海藻酸钠水凝胶）为 hMO 和 T 细胞提供更接近体内的三维空间结构，促进细胞外基质（ECM）相互作用，增强类器官的成熟度和 T 细胞的浸润效率。

操作要点

• 支架制备
• 将 hMO 嵌入含 ECM 成分（如层粘连蛋白、纤维连接蛋白）的水凝胶中，支架孔隙率控制在 100-200 μm（允许 T 细胞迁移）。
• 共培养
• 在支架周围接种 T 细胞，使用 hMOM+IL-2 培养基，通过 confocal 显微镜观察 T 细胞在支架内的迁移路径及与 hMO 的空间接触。
• 优势
• 支架可调节硬度（模拟脑内不同区域的机械特性），研究力学信号对 T 细胞 - 神经元互作的影响（如中脑区域的软硬度是否促进 T 细胞浸润）。

五、疾病特异性共培养模型

原理

文中使用健康供体的 hMO 和 T 细胞，而疾病特异性模型可通过引入 PD 患者来源的细胞，更精准模拟病理状态下的免疫 - 神经互作。

操作要点

• PD 患者 hMO
• 从 PD 患者皮肤成纤维细胞重编程为 hiPSC，诱导分化为 hMO（携带 PD 相关突变，如 LRRK2 G2019S），其多巴胺能神经元通常表现出 α- 突触核蛋白聚集、线粒体功能异常等表型。
• PD 患者 T 细胞
• 分离 PD 患者外周血 T 细胞（可能存在异常激活表型，如 Th17 细胞比例升高）。
• 共培养
• 采用文中优化的 hMOM+IL-2 条件，对比患者与健康对照的 T 细胞浸润能力、神经损伤程度，揭示 PD 特异性免疫机制。

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