技术分享 | 细胞复苏和冻存Protocol

一、细胞复苏

正确的细胞复苏技术对于维持细胞活力和功能至关重要，这是科学研究、细胞治疗和生物生产过程的重要步骤。

 

背 景

不正确的细胞复苏方法会导致细胞损伤、活力丧失和细胞特征改变，从而影响研究结果或治疗效果的可靠性和可重复性。通过采用适当的解冻方法，如逐步加热和使用保护剂，可以保持细胞完整性、遗传稳定性和功能特性，从而最大限度地提高

下游应用的效率和成功率。此外，遵循标准化的复苏方法可以最大限度地减少实验变异性，提高可重复性。

 

实验步骤

 

Tips

• 为了获得最佳的复苏效果，可使用BPS Bioscience的经验证和优化的培养基。

• 收到新的细胞系时，建议扩增细胞并在早期传代时至少冻存10管以备将来使用。

• 解冻培养基不能含选择性抗生素。

 

 

贴壁细胞复苏Protocol

 

该Protocol适用于贴壁细胞系（如HEK293，CHO或HeLa细胞）。

 

1.在37°C水浴中旋转冷冻的细胞冻存管约60秒。细胞解冻后（可能略快或略慢于60秒），立即将冻存管内的细胞迅速转移到含有10 ml预热Thaw Medium（不含选择性抗生素）的离心管中。如果将细胞长时间留在37°C的水浴中会导致活力迅速丧失。

• 步骤1的替代方法：解冻后立即将冻存管的细胞快速转移到一个空的50 ml锥形管中，然后慢慢滴加10 ml预热的Thaw Medium，同时轻轻摇动锥形管，以实现温和混合，避免渗透冲击。

 

2.立即以300 g离心5分钟，去除培养基，并将细胞重悬于5 ml预热的Thaw Medium中（无选择性抗生素）。

 

3. 将重悬的细胞转移到一个T25瓶或T75瓶中，并在37°C、5% CO2的培养箱中孵育。

 

4. 培养24小时后，检查细胞附着和活力。更换为新鲜解冻培养基，并继续在37°C、5% CO2的培养箱中培养，直到细胞准备好传代。

 

5. 细胞应在完全融合之前传代。在第一次传代和后续传代时，使用含有适当选择性抗生素的生长培养基。

 

 

 

悬浮细胞复苏Protocol

 

此Protocol适用于悬浮细胞系，如Jurkat、THP-1等。

 

1. 在37°C水浴中旋转冷冻的细胞Thaw Medium约60秒。细胞解冻后（可能略快或略慢于60秒），立即将冻存管内的细胞迅速转移到含有10 ml预热Thaw Medium（不含选择性抗生素）的离心管中。如果将细胞长时间留在37°C的水浴中会导致活力迅速丧失。

• 步骤1的替代方法：解冻后立即将冻存管内的细胞快速转移到一个空的50 ml锥形管中，然后慢慢滴加10 ml预热的Thaw Medium，同时轻轻摇动锥形管，以实现温和混合，避免渗透冲击。

 

2.立即以300 g离心5分钟，去除培养基，并将细胞重悬于5 ml预热的Thaw Medium中（无选择性抗生素）。

 

3. 将重悬的细胞转移到一个T25瓶中，并在37°C、5% CO2的培养箱中孵育。

 

4. 培养24小时后，检查细胞活力。对于T25瓶，添加3-4 ml Thaw Medium（无选择性抗生素），并继续在37°C、5% CO2的培养箱中培养，直到细胞准备好传代。

 

5. 细胞应在密度达到约2 x 10^6 细胞/ml之前传代。在第一次传代和后续传代时，使用含有适当选择性抗生素的生长培养基。

 

外周血单个核细胞（PBMC）复苏Protocol

 

此Protocol适用于适用于冷冻保存的PBMC或纯化的T细胞等。

 

1. 在37°C水浴中旋转冷冻的细胞冻存管，直到冻存管中细胞90%解冻。

• 注意：将细胞长时间留在37°C的水浴中会导致活力迅速丧失。

   

2. 用70%乙醇清洁冻存管外部。

 

3. 细胞解冻后，立即将冻存管的全部细胞迅速转移到一个15 ml管中。

 

4. 用Thaw Medium10 (#79704)冲洗冻存管，以回收更多细胞。

 

5. 缓慢加入10 ml预热的Thaw Medium 10 (#79704)。

 

6. 通过倒置试管轻轻混合。

 

7. 立即以200g离心10分钟，在室温下进行。

 

8. 用移液器小心地去除上清液，避免扰动沉淀。

 

9. 将沉淀重悬于10 ml预热的Thaw Medium 10 (#79704)。

 

10.通过倒置试管轻轻混合。

 

11.以200g离心10分钟，在室温下进行。

 

12.用移液器小心地去除上清液，避免扰动沉淀。

• 注意：在洗涤步骤中可能会损失高达20%的细胞。

   

13. 细胞现在可以用于下游应用。

 

 

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二、细胞冻存

 

细胞冷冻在保存细胞活力、维持遗传完整性、实现长期存储和运输以及提高生物和医学研究实验的效率和可重复性方面起着至关重要的作用。

背 景

细胞冻存是细胞生物学的基石，对于维持细胞系的健康和稳定性至关重要。冷冻细胞有多项好处，包括减少连续培养维护的需要，降低成本和劳动强度，有利于细胞系的转运，实现长期存储，最小化因反复传代导致的细胞系变异等。

 

实验步骤

 

Tips

• 为了获得最佳效果，可以使用BPS Bioscience验证和优化的培养基。

• 当接收到新的细胞系时，建议扩增细胞并在早期传代时至少冻存10管以备将来使用。

 

 

贴壁细胞冻存Protocol

 

该Protocol适用于贴壁细胞系（如HEK293，CHO或HeLa细胞）。

 

1. 吸出培养基，用无Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞，并用0.05%的胰蛋白酶/EDTA或其他解离液将细胞从培养皿中消化下来。

 

2. 细胞分离后，加入生长培养基并计数细胞。

 

3. 以300 x g离心5分钟，去除培养基，并将细胞重悬于4°C的Cell Freezing Medium (#79796)，密度约为2 x 10^6细胞/ml。

 

4. 将1 ml细胞分装到适当的冻存管中。再将冻存管放入隔热容器（如程序/梯度降温盒）中进行缓慢冷却，并在-80°C过夜存放。

 

5. 第二天将冻存管转移到液氮中进行存储。

 

 

 

悬浮细胞冻存Protocol

此Protocol适用于悬浮细胞系，如Jurkat、THP-1等，或外周血单个核细胞（PBMC）。

 

1. 以300 x g离心5分钟，去除培养基，并将细胞沉淀重悬于4°C的Cell Freezing Medium (#79796) ，密度约为2 x 10^6 细胞/ml。

 

2. 将1 ml细胞分装到适当的冻存管中。再将冻存管放入隔热容器（如程序/梯度降温盒）中进行缓慢冷却，并在-80°C过夜存放。

 

3. 第二天将冻存管转移到液氮中进行存储。

 

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编译自

1.https://bpsbioscience.com/protocols