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IF39.3|人原代心肌细胞分离、培养、冻存条件优化

人阅读 发布时间:2023-11-22 09:47

心血管疾病是全球最常见的死亡原因之一。准确模拟心脏稳态、功能障碍和药物反应是心脏研究的核心。直接从人类心脏组织中分离出来的成人原代心肌细胞(hPCMs是一种很有前途的细胞模型,但不稳定的分离效率和质量、培养中的快速细胞死亡以及对冷冻保存的未知反应使它们无法成为可靠且灵活的体外心脏模型。
心血管疾病国家重点实验室胡盛寿院士、王利教授、周冰莹副研究员团队在Signal Transduct Target Ther.发表了题为Functional isolation, culture and cryopreservation of adult human primary cardiomyocytes的文章,对成人原代心肌细胞的分离、培养、冻存的步骤进行多个优化,同时检测了细胞活力、线粒体呼吸以及药物反应有关指标,显示其在体外高效分离和长期维持功能性,可成为心血管研究、药物发现和安全性药理学潜力细胞模型百洋智心与国家心血管病中心、中国医学科学院阜外医院深圳医院的合作,完成了人原代心肌细胞的产品转化,拥有人原代心肌细胞储备、分离、培养及冻存技术。


人多能干细胞(hPSC)来源的心肌细胞(hPSC-CMs)已成为近年来受欢迎的体外模型之一,可是hPSC来源的细胞在许多方面表现出未成熟的表型,包括细胞结构,基因表达,代谢和电生理学。相比之下,直接从人类心脏组织中分离出来的人原代心肌细胞(hPCMs)实际上具有细胞模型的所有所需元素(例如,天然结构和功能,患者特异性遗传和表观遗传信息等),因此理论上是理想的细胞模型;但是目前基于hPCM的研究仅限于使用急性分离的细胞,并且细胞数量有限,因为缺乏可靠和可重复的hPCM分离和培养方法,故该作者做了以下的研究: 

 一、优化分离成人原代心肌细胞的条件

添加布雷他汀((-)-Blebbistatin)进行分离,与非选择性肌球蛋白 ATP 酶抑制剂二乙酰一肟(BDM)相比,成人原代心肌细胞的细胞活力比传统方法提高 2.74 倍,以及更好细胞形态和完整电生理性,另外用RNA-seq方法比较心肌组织与同一组织分离出的原代心肌细胞,结果表明分离的心肌细胞的基因表达几乎不受影响







测试新鲜分离的人原代心肌细胞的功能完整性。首先使用膜片钳检测心肌细胞的主要膜电流及其对特定抑制剂的反应,数据共同证明了分离的人原代心
肌细胞具体的适当的离子电流,表明它们可能用作评估影响心肌细胞电特性的药物的模型。接下来,使用异丙肾上腺和去甲肾上腺来检查细胞是否对神经激素刺激有反应,证明细胞在分离后保留了功能性肾上腺能信号传导。通过JC-1染色评估了线粒体膜电位,表明细胞具有健康的线粒体




二、优化成人原代心肌细胞的培养条件
目前,缺乏有效的培养方法来长时间维持分离的成年哺乳动物心肌细胞的分化状态。作者通过添加Bleb以及选择最适合的基础培养基MEM、确定了最适合心肌细胞生长的基质-层粘连蛋白保证了人原代心肌细胞的培养条件,维持正常和患病的人原代心肌细胞在培养中保留特征性的杆状形态。



通过免疫荧光评估了Bleb培养的心肌细胞的结构完整性;由于代谢完整性是心肌细胞功能的关键,同时也评估培养物中的hPCMs是否维持适当的代谢, 数据表明培养物中的hPCMs在结构和代谢上是完整的



三、冷冻保存成人原代心肌细胞
进一步扩展hPCM细胞模型的应用,作者冷冻保存hPCMs,细胞的存活率仅比新鲜分离细胞低10%,实现了66.74%的平均细胞回收率。冷冻保存的细胞表现出完整的结构,具有清晰的条纹,无差异表达基因,这表明保存的细胞结构与新鲜分离的细胞十分接近且对hPCMs的分子和功能完整性损害,暗示hPCMs冷冻保存技术可用于体外实验,例如评估药物效果。后续检查了四种已知心脏毒性药物的剂量反应,表明可以使用hPCMs进行高通量和高内涵筛选的可能性。




四、评估成人原代心肌细胞的药效结果
心脏毒性是药物在开发和由于不良心血管事件而退出市场的主要原因之一。人原代心肌细胞作为在药物发现过程的早期检测心脏毒性的体外模型的可靠性至关重要,作者测试了西沙必利、氟哌利多、罗非昔布和罗格列酮由于心脏副作用而退出市场的五种药物在hPCMs的剂量反应,表明hPCMs可能对直接心肌细胞毒性更敏感;进一步使用了一组具有已知毒性特征的激酶抑制剂,结果表明hPCMs可能是评估药物开发中心脏毒性的可靠模型



hPCMs和hiPSC-CMs的药物反应差异,作者用指示药物治疗来自五个供体的hPCMs和来自三个个体的人诱导多能干细胞48小时衍生心肌细胞(hiPSC-CMs),并通过批量和单细胞RNA测序(scRNA-seq)检测其基因表达变化;单细胞RNA测序(scRNA-seq)和GO分析提供了hPCMs药物治疗反应优先响应与心脏功能相关的基因变化而hiPSC-CMs表现出心脏发育特征不同的证据。


综上所述, 不稳定的分离效率和质量、培养中的快速细胞死亡以及对冷冻保存的未知反应使它们无法成为可靠且灵活的体外心脏模型的hPCMs,经过作者优化的分离和培养条件以及冷冻保存的hPCMs在细胞形态、电生理、线粒体、基因表达、功能以及药物反应都是佳的,可作为心血管研究、药物发现和安全性药理学潜在的理想细胞模型

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