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公司新闻/正文
二抗的标记
1897 人阅读发布时间：2023-07-25 10:36
一、二抗是指靶向结合一抗的抗体
在ELISA、西方墨点法及免疫萤光等免疫实验中，占有举足轻重的地位，重要性并不亚于直接与受测物的一抗，因此为了获得理想的实验结果，正确选择出一种适合应用的二抗也是相当重要的。
二抗挑选的考虑因素
二抗挑选的考虑因素如下
一抗的种属：二抗的免疫物种需要和一抗的种属来源一致，例如一抗来源为小鼠，二抗则为抗小鼠的抗体。
二抗的种属：虽然二抗的种属来源对实验质量没有太大的影响，但一些实验中需要使用两种种属以上的一抗，需要避免二抗之间产生非实验预期的连结。
二抗的偶联标记
挑选二抗的偶联标记，主要有酶 (HRP、AP)，萤光基团(PE、AFluor、FITC等)，金颗粒及生物素等。Western Blot 和 ELISA，最常使用酶标二抗。
组织免疫、细胞免疫及流式细胞术常使用萤光基团的二抗。免疫电镜常用金标记的二抗。
二、抗体的标记有哪些？
抗体标记是指将标记物（酶、荧光染料、生物素、胶体金等）以共价结合或物理吸附的方式与抗体进行连接，形成抗体-标记物复合物。
下面介绍几种常见的抗体标记方法：
一、酶标记
以共价键结合的方式将酶联结在抗体上，得到酶标抗体复合物，之后借助酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，这些有色产物可用肉眼、显微镜、分光光度计等进行观察或测定，从而证明发生了相应的免疫反应。在生命科学的科学研究过程中，最常用的抗体标记酶包含辣根过氧化物酶 (HRP)和碱性磷酸酶 (AP)。1、辣根过氧化物酶标记辣根过氧化物酶标记抗体一般采用NaIO₄法。NaIO₄法的原理是通过NaIO₄将HRP的糖基氧化成醛基，该醛基可与抗体IgG上的氨基进行结合，形成Schiff氏碱。2、碱性磷酸酶标记碱性磷酸酶标记抗体时最常用的是C5H8O2一步法。在标记时，先将碱性磷酸酶与单抗混合，之后加入适量的C5H8O2，使碱性磷酸酶和抗体蛋白的氨基分别与两个醛基结合，进而形成结合物。
二、荧光染料标记
荧光标记技术是指将能发射荧光的标记物通过共价结合或物理吸附等方式标记于目标分子的某个基团上，从而利用标记物的荧光特性来反映研究对象的信息。常见的荧光染料包含小分子荧光染料、时间分辨荧光材料、上转化发光材料、量子点荧光材料等。
2、时间分辨荧光材料、上转化发光材料、量子点荧光材料是三种新型的荧光材料，其中，时间分辨荧光材料以镧系元素, 如铕 (Eu)、铽 (Tb)、钐 (Sm)等标记抗体, 利用时间分辨荧光仪特定的延迟一段时间测量，获得镧系元素的特异荧光信号；上转化发光材料是在受到低能量的光激发情况下，发射出高能量的光，即经波长长、频率低的光激发，材料发射出波长短、频率高的光；量子点 (quantum dots)是一类由Ⅱ－Ⅵ族或Ⅲ－Ⅴ族元素组成的能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒，量子点荧光强度高且持续时间长，光化学性质非常稳定，不易发生光漂白，可经受反复多次的激发，这为研究生物细胞内分子之间的长时间作用提供了有力的工具。
在标记方法上，这三种荧光材料一般会利用表面羧基基团与抗体的氨基基团进行偶联。
三、生物素标记
生物素标记反应常用生物素琥珀酰亚胺酯进行。生物素是与抗体分子的游离赖氨酸等发生偶联反应而完成标记。
一般一个抗体可以标记3-5个生物素，标记时，生物素与抗体的比率受抗体浓度影响，对于10 mg/ml 的抗体溶液来说，生物素应超过蛋白12倍（摩尔数），对于2 mg/ml 的抗体溶液应超过20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。
四、胶体金标记
胶体金标记是利用氯金酸在还原剂作用下聚合成直径 1~150nm的金颗粒, 形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用成为稳定的胶体状态, 称胶体金。
胶体金标记就是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理是胶体金颗粒具有高电子高密度的特性, 其表面的负电荷能与蛋白质的正电荷基团静电吸附而牢固结合。
在ELISA、西方墨点法及免疫萤光等免疫实验中，占有举足轻重的地位，重要性并不亚于直接与受测物的一抗，因此为了获得理想的实验结果，正确选择出一种适合应用的二抗也是相当重要的。
二抗挑选的考虑因素
二抗挑选的考虑因素如下
一抗的种属：二抗的免疫物种需要和一抗的种属来源一致，例如一抗来源为小鼠，二抗则为抗小鼠的抗体。
二抗的种属：虽然二抗的种属来源对实验质量没有太大的影响，但一些实验中需要使用两种种属以上的一抗，需要避免二抗之间产生非实验预期的连结。
二抗的偶联标记
挑选二抗的偶联标记，主要有酶 (HRP、AP)，萤光基团(PE、AFluor、FITC等)，金颗粒及生物素等。Western Blot 和 ELISA，最常使用酶标二抗。
组织免疫、细胞免疫及流式细胞术常使用萤光基团的二抗。免疫电镜常用金标记的二抗。
二、抗体的标记有哪些？
抗体标记是指将标记物（酶、荧光染料、生物素、胶体金等）以共价结合或物理吸附的方式与抗体进行连接，形成抗体-标记物复合物。
下面介绍几种常见的抗体标记方法：
一、酶标记
以共价键结合的方式将酶联结在抗体上，得到酶标抗体复合物，之后借助酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，这些有色产物可用肉眼、显微镜、分光光度计等进行观察或测定，从而证明发生了相应的免疫反应。在生命科学的科学研究过程中，最常用的抗体标记酶包含辣根过氧化物酶 (HRP)和碱性磷酸酶 (AP)。1、辣根过氧化物酶标记辣根过氧化物酶标记抗体一般采用NaIO₄法。NaIO₄法的原理是通过NaIO₄将HRP的糖基氧化成醛基，该醛基可与抗体IgG上的氨基进行结合，形成Schiff氏碱。2、碱性磷酸酶标记碱性磷酸酶标记抗体时最常用的是C5H8O2一步法。在标记时，先将碱性磷酸酶与单抗混合，之后加入适量的C5H8O2，使碱性磷酸酶和抗体蛋白的氨基分别与两个醛基结合，进而形成结合物。
二、荧光染料标记
荧光标记技术是指将能发射荧光的标记物通过共价结合或物理吸附等方式标记于目标分子的某个基团上，从而利用标记物的荧光特性来反映研究对象的信息。常见的荧光染料包含小分子荧光染料、时间分辨荧光材料、上转化发光材料、量子点荧光材料等。
- 关于小分子荧光染料的报道中，常用到的荧光基团多为芳香族的化合物，在抗体标记过程中常用到的小分子染料包含以下几类：
- 荧光素类 (如FITC)：异硫氰酸荧光素 (FITC)是目前应用最为广泛的一种荧光素衍生物，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC标记抗体是基于FITC 的异硫氰基在碱性条件下能与IgG的自由氨基结合，进而形成IgG与荧光素的结合物。
- 罗丹明类：是以氧杂蒽为母体的碱性呫吨染料，是生物医学中常用的一类荧光染料，一般通过与被标记物的氨基结合实现标记。
- 花菁类荧光染料 (如Cy系列染料)：菁染料在光照下不稳定，但具有摩尔消光系数高、光谱范围广且光量子点产率高等特性，在使用时可通过染料的NHS与抗体的氨基连接，进而形成结合复合物。
- 罗丹明或香豆素等染料的衍生物 (如Alexa Fluor)：Alexa Fluor通过利用磺酸或磺酸盐代替罗丹明或香豆素等染料中的氢原子而合成，主要通过磺酸酯活性基团与生物分子中的伯胺相结合形成琥珀酰亚胺酯稳定结构，从而实现对蛋白质、核酸等生物分子的 Alexa Fluor 荧光标记。
2、时间分辨荧光材料、上转化发光材料、量子点荧光材料是三种新型的荧光材料，其中，时间分辨荧光材料以镧系元素, 如铕 (Eu)、铽 (Tb)、钐 (Sm)等标记抗体, 利用时间分辨荧光仪特定的延迟一段时间测量，获得镧系元素的特异荧光信号；上转化发光材料是在受到低能量的光激发情况下，发射出高能量的光，即经波长长、频率低的光激发，材料发射出波长短、频率高的光；量子点 (quantum dots)是一类由Ⅱ－Ⅵ族或Ⅲ－Ⅴ族元素组成的能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒，量子点荧光强度高且持续时间长，光化学性质非常稳定，不易发生光漂白，可经受反复多次的激发，这为研究生物细胞内分子之间的长时间作用提供了有力的工具。
在标记方法上，这三种荧光材料一般会利用表面羧基基团与抗体的氨基基团进行偶联。
三、生物素标记
生物素标记反应常用生物素琥珀酰亚胺酯进行。生物素是与抗体分子的游离赖氨酸等发生偶联反应而完成标记。
一般一个抗体可以标记3-5个生物素，标记时，生物素与抗体的比率受抗体浓度影响，对于10 mg/ml 的抗体溶液来说，生物素应超过蛋白12倍（摩尔数），对于2 mg/ml 的抗体溶液应超过20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。
四、胶体金标记
胶体金标记是利用氯金酸在还原剂作用下聚合成直径 1~150nm的金颗粒, 形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用成为稳定的胶体状态, 称胶体金。
胶体金标记就是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理是胶体金颗粒具有高电子高密度的特性, 其表面的负电荷能与蛋白质的正电荷基团静电吸附而牢固结合。