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技术资料/正文
如何正确选择二抗？
905 人阅读发布时间：2023-07-25 09:45
你是否在选择二抗的时候遇到过以下的情况：
IHC/IF多标实验中一抗二抗种属傻傻分不清？
荧光标记不知道怎么选择？
IHC实验结果不准确，遇到高背景、假阳性的情况？
一抗种属来源相同时，不知该选择什么样的二抗来进行同步法IF双标记染色？
IP/Co-IP后的WB实验出现非特异性条带？
作为免疫学实验不可或缺的工具，我们一般会使用一抗和二抗两种抗体。简单来说，二抗有如下优点：省钱、提高灵敏度、提高准确度、检测波长更灵活等。在上一篇推文中，我们讨论了实验如何选择合适的一抗，本期小编主要和大家探讨一下二抗的选择要点。
二抗可用来检测细胞或组织样品中的蛋白质表达。二抗与抗原特异性的一抗结合使用，可实现对目标蛋白内高度特异性的氨基酸进行检测。二抗对一抗指定区域或多个区域的特异性，允许多个二抗与单个一抗结合，放大信号并提高检测灵敏度。
一、了解什么是二抗
二抗是用来识别这个一抗的二级抗体，二抗具有偶联标记。一般来讲，偶联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP等），荧光基团（FITC, TR, PE）和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于IHC, WB和ELISA，常用的二抗是酶标二抗，而细胞或组织的免疫荧光实验和流式细胞术中通常使用荧光基团标记的二抗。
二、二抗是如何产生的
二抗是在动物中生产并收集的，具体方法是用另一种动物的抗体来免疫动物。用于免疫的抗体的特性（如种属、亚类、片段等）决定了二抗的特异性。例如，兔抗大鼠lgG2b（H+L）二抗是用大鼠lgG2b免疫球蛋白分子的重链和轻链来免疫兔子而生产的。
三、二抗有哪些优势？
由于多个二抗可以与单个一抗结合（信号放大），1、二抗提高了检测的灵敏度。2、 不受一抗的限制；3、 放大检测信号；4、 试剂的灵活性；5、 经济实惠
直接检测：带有单个偶联物的抗体靶向结合感兴趣的目标；
间接检测：使用不带偶联物的一抗以及带有偶联物的二抗。
四、应该如何选择合适的二抗宿主？
二抗应直接针对一抗种属，而不是来自于与一抗相同的种属。要选择出一种最适用于您的应用和研究的最佳二抗，建议考虑以下因素：
● 种属来源和种属反应性
● 特异性反应
● 纯化方法
● 交叉吸附
● 多重检测能力
● 抗体类型和亚型
● 完整抗体还是抗体片段
● 标记物
● 生物素结合蛋白
五，选择哪种形式的二抗，是整个IgG分子，Fab片段，还是F(ab')2片段？
整个IgG分子：此种抗体适用于多数情况。
Fab片段：它们只有一个结合位点，一般用来封闭内源性免疫球蛋白。
F(ab')2片段：该种抗体是由两个靠二硫键连接的用于结合抗原的Fab片段组成，这些抗体用在特定的情况中，如需要避免抗体与具有Fc受体的细胞结合的情况。
1.选择正确的种属来源和反应物种
二抗的选择首要基于一抗，应与一抗的种属来源相对应，且需要来自于不同的物种（如下图所示）。
❖轻链特异性
❖Fc端特异性
❖亚型特异性
六、二抗的类别亚型
01、IgM是体液免疫应答首先产生的Ig
02、IgA是机体黏膜防御感染的重要因素
03、IgG是初级免疫应答中最持久、最重要的抗体，它仅以单体形式存在。大多抗菌性、抗毒性和抗病毒抗体属于IgG
04、IgE是同速发型过敏反应发生有关的Ig
05、IgD以膜结合形式存在于B细胞，在B细胞分化发育中起重要调节作用
IHC/IF多标实验中一抗二抗种属傻傻分不清？
荧光标记不知道怎么选择？
IHC实验结果不准确，遇到高背景、假阳性的情况？
一抗种属来源相同时，不知该选择什么样的二抗来进行同步法IF双标记染色？
IP/Co-IP后的WB实验出现非特异性条带？
作为免疫学实验不可或缺的工具，我们一般会使用一抗和二抗两种抗体。简单来说，二抗有如下优点：省钱、提高灵敏度、提高准确度、检测波长更灵活等。在上一篇推文中，我们讨论了实验如何选择合适的一抗，本期小编主要和大家探讨一下二抗的选择要点。
二抗可用来检测细胞或组织样品中的蛋白质表达。二抗与抗原特异性的一抗结合使用，可实现对目标蛋白内高度特异性的氨基酸进行检测。二抗对一抗指定区域或多个区域的特异性，允许多个二抗与单个一抗结合，放大信号并提高检测灵敏度。
一、了解什么是二抗
二抗是用来识别这个一抗的二级抗体，二抗具有偶联标记。一般来讲，偶联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP等），荧光基团（FITC, TR, PE）和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于IHC, WB和ELISA，常用的二抗是酶标二抗，而细胞或组织的免疫荧光实验和流式细胞术中通常使用荧光基团标记的二抗。
二、二抗是如何产生的
二抗是在动物中生产并收集的，具体方法是用另一种动物的抗体来免疫动物。用于免疫的抗体的特性（如种属、亚类、片段等）决定了二抗的特异性。例如，兔抗大鼠lgG2b（H+L）二抗是用大鼠lgG2b免疫球蛋白分子的重链和轻链来免疫兔子而生产的。
三、二抗有哪些优势？
由于多个二抗可以与单个一抗结合（信号放大），1、二抗提高了检测的灵敏度。2、 不受一抗的限制；3、 放大检测信号；4、 试剂的灵活性；5、 经济实惠
直接检测：带有单个偶联物的抗体靶向结合感兴趣的目标；
间接检测：使用不带偶联物的一抗以及带有偶联物的二抗。
四、应该如何选择合适的二抗宿主？
二抗应直接针对一抗种属，而不是来自于与一抗相同的种属。要选择出一种最适用于您的应用和研究的最佳二抗，建议考虑以下因素：
● 种属来源和种属反应性
● 特异性反应
● 纯化方法
● 交叉吸附
● 多重检测能力
● 抗体类型和亚型
● 完整抗体还是抗体片段
● 标记物
● 生物素结合蛋白
五，选择哪种形式的二抗，是整个IgG分子，Fab片段，还是F(ab')2片段？
整个IgG分子：此种抗体适用于多数情况。
Fab片段：它们只有一个结合位点，一般用来封闭内源性免疫球蛋白。
F(ab')2片段：该种抗体是由两个靠二硫键连接的用于结合抗原的Fab片段组成，这些抗体用在特定的情况中，如需要避免抗体与具有Fc受体的细胞结合的情况。
1.选择正确的种属来源和反应物种
二抗的选择首要基于一抗，应与一抗的种属来源相对应，且需要来自于不同的物种（如下图所示）。
- 选择正确的二抗形式
- 抗体特异性的选择
❖轻链特异性
❖Fc端特异性
❖亚型特异性
六、二抗的类别亚型
01、IgM是体液免疫应答首先产生的Ig
02、IgA是机体黏膜防御感染的重要因素
03、IgG是初级免疫应答中最持久、最重要的抗体，它仅以单体形式存在。大多抗菌性、抗毒性和抗病毒抗体属于IgG
04、IgE是同速发型过敏反应发生有关的Ig
05、IgD以膜结合形式存在于B细胞，在B细胞分化发育中起重要调节作用