一文教你高效无痕敲除细胞基因

1.选用健康细胞： 实验前需使用生长旺盛、状态良好的细胞，并严格确保细胞无细菌、真菌或支原体污染。

2.细胞复苏要求： 若使用近期从液氮复苏的冻存细胞，在转染操作前应至少进行两次传代培养，以保证细胞活力和适应性。

3.接种密度控制： 转染操作前24小时，需将细胞接种到24孔板中。

4.贴壁细胞目标： 转染时细胞应达到50%~60%的汇合度（即细胞覆盖培养皿底面积的百分比）。

5.悬浮细胞目标： 转染时细胞数量应控制在 1.2×10⁵ ~ 1.6×10⁵ 个/孔。

1.复合物解冻：转染前，需将构建好的载体-RNP复合物从-80℃冰箱提前转移至4℃冰箱进行缓慢解冻。

2.转染操作：

贴壁细胞：若细胞状态良好、分布均匀且汇合度达到50%~60%，可直接将解冻的复合物加入孔中。
加入方式：每孔加入10 μL，分多次缓慢加入，加入后轻轻晃动培养板混匀。

悬浮细胞：若细胞状态良好，在加入复合物前需轻柔吹散细胞团块，确保细胞均匀分散，之后直接加入复合物。
加入方式：每孔加入10 μL，分多次缓慢加入，加入后轻轻晃动混匀。

1.基因组提取：在完成转染操作48小时后，提取转染细胞的基因组DNA。
靶标区域扩增：使用特异性引物对包含sgRNA靶向切割位点的靶标区域（扩增子） 进行PCR扩增。

2.初步验证：可将PCR产物直接进行琼脂糖凝胶电泳分析。若Pool裂解产物（即混合样本）的PCR条带呈现单一且大小与设计理论值相符，则表明扩增成功，可直接进行下一步测序。

3.基因编辑效率分析：将PCR产物进行Sanger测序。利用测序结果，通过专门的在线分析工具来计算和评估实验的基因编辑效率。