纳米抗体靶点筛选，助力肿瘤 CAR-T 细胞疗法持续发展！

1993年，比利时科学家哈莫斯卡斯特曼，在Nature上首次报道骆驼科动物的外周血中，有部分缺失轻链只有重链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区VHH和两条CH2与CH3区，且保留了全部的抗原结合能力，是自然存在的可以和抗原结合的最小片段。该抗体被称为单域抗体，又称纳米抗体(VHH抗体, Nanobody)。单域抗体作为抗肿瘤的新型分子类型，其主要优势在于：

1）高特异性、组织穿透力强

纳米抗体很小，识别隐藏表位，可结合传统的抗体结合不到的位点。

2）易改造和优化

基因工程兼容，允许支架和氨基酸的改变，偶联和人源化都更容易，可组合性高（双价/多价及融合VHH）。

3）免疫原性低

纳米抗体和人IgG重链地序列80%以上一致。

4）亲水性佳、可溶性好

传统抗体的FR2的4个疏水氨基酸突变为纳米抗体中的亲水氨基酸。

5）适合工业大规模生产

生产成本较低，可以大规模、低成本的在多种系统中表达（E.coil，yeast，哺乳动物、植物表达系统等）。

6）更高的稳定性

在高温（80℃）、极端PH条件下仍然保持生物活性，这可解决生物制剂冷链运输和储存的难题。


1 CAR-T细胞治疗   搭配纳米抗体展现更高效率

CAR-T细胞疗法早已应用于抗肿瘤疾病，FDA曾批准了CD19嵌合抗原受体CAR-T细胞产品，CD19 CAR-T细胞治疗对复发和难治性B细胞恶性肿瘤患者有很好的疗效。然而，后续数据显示，只有30-50%的患者经历了长期疾病控制^[1]。

Nature communications 发表的题为The lgG4 hinge with CD28 transmembrane domain improves V_HH-based CAR T cells targeting a membrane-distal epitope of GPC1 in pancreatic cancer 的研究论文，Nan Li^[2]等人设计了靶向Glypican-1（GPC1）的CAR产品，主要用于治疗胰腺肿瘤，GPC1是一种在许多胰腺癌中高表达的表面蛋白。


在研究中，Nan Li团队分别开发了以VHH抗体D4 VHH和单克隆抗体HM2为基础的靶向GPC1的CAR-T细胞（图2），并通过多组实验比较了二者在治疗胰腺肿瘤的差异性。


实验结果显示，在两种药物处理细胞和小鼠后，发现D4 VHH和单克隆抗体HM2均可以促进有效的肿瘤杀灭和整体持久性。但D4-CAR产品在他们的模型中具有更高的转导效率和肿瘤清除率（图3），与HM2-CAR相比，研究小组更关注D4-CAR产品。

众多研究表明，影响CAR功效的的原因有很多。最初，CAR-T细胞的靶向结构域主要基于scFv抗体，但scFv抗体VH和VL之间需要肽连接体。在CAR-T细胞注射用药后，由于连接体的免疫原性，会使宿主免疫系统产生药物抗体（ADA），从而形成中和抗体来介导针对此类连接体的免疫反应。

相反，相对于scFv抗体（表1），首先VHH抗体的序列更类似于人类重链可变区。其次，在VHH抗体介导的情况下，由于VHH抗体缺乏连接肽，从而可更好的避免CAR表面聚集和靶抗原非依赖性效应细胞激活的局限性，且免疫原性更低。

2 纳米抗体的CAR-T细胞疗法正在不断崛起

目前全球已有多款VHH抗体的CAR-T细胞治疗药物上市或者处于临床实验的不同阶段，治疗的疾病有多发性骨髓瘤、B淋巴细胞白血病、食道癌、胃癌、 消化系统肿瘤、 胰腺癌、 卵巢癌、腺癌等肿瘤，下表整理了一些进入临床或上市的基于纳米抗体的药物项目：



已上市

2022年02月28日，西达基奥仑赛cilta-cel（Carvykti）获得FDA批准，由南京传奇生物科技有限公司销售 ，这是一款基于纳米抗体的自体BCMA CAR-T疗法，适应症为复发性/难治性多发性骨髓瘤（R/R MM）。据相关报道，传奇生物的Carvykti上半年合计销售额近2亿美元。


临床一期

2023年3月24日上海细胞治疗集团有限公司研发的自分泌PD1抗体靶向间皮素CAR-T（anti-PD1 MSLN-CAR-T，BZDS1901），顺利通过国家药审中心科学审评审批进入临床一期研究，该药主要用于治疗实体瘤、非小细胞肺癌、间皮组织肿瘤、结直肠癌和卵巢癌。这也是国内目前最早自分泌纳米抗体CAR-T细胞药物获批进入临床药物。


纳米抗体的CAR-T细胞治疗行业正迎来主升期，已然成为未来一个重要的产业。

3 百英生物VHH纳米抗体开发平台

百英生物自主开发的新一代纳米抗体开发平台，依托高通量自动化哺乳动物细胞表达系统，借助于单个B细胞抗体开发、噬菌体展示平台、NGS高通量测序技术，可为客户提供基于VHH纳米抗体研发与生产的全方位的服务。百英还拥有纳米抗体天然库筛选对外服务，比常规通过免疫方式节省1个半月，适用于低免疫原性和毒性抗原的筛选。


(1) 自建羊驼基地

来源清晰，科学管理，免疫效果好


(2) 纳米抗体制备服务流程

以噬菌体文库淘选为例，整个服务至少3轮淘选(包括液相和固相同时进行)，对阳性克隆进行ELISA验证、鉴定、筛选和克隆测序，保证序列的正确率。

(3) 案例分享-抗体表达与鉴定
 

目的：制备羊驼VHH Anti-X 抗体

样本：Human X & Cyno x(Full length)抗原;羊驼N号

实验结果：

（1）固相、液相淘选结果

（2）单克隆筛选结果，得到24个Unique sequence



(4) 纳米抗体一站式筛选平台

目前百英生物已配套纳米抗体人源化和亲和力成熟等抗体工程改造服务，详细服务可线上或线下进行咨询。