pET28a-EGFP大肠杆菌的高效表达与纯化全攻略

       在分子生物学和蛋白质研究的璀璨星河中，绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP） 无疑是一颗耀眼的明星。源自维多利亚多管水母的GFP，因其能在特定波长光激发下发出明亮的绿色荧光，且无需添加底物或辅助因子，已成为研究基因表达、蛋白质定位、细胞动态追踪以及高通量筛选等领域的革命性工具。

智立中特(武汉)生物科技有限公司 专注于为您提供前沿、可靠的生物技术解决方案。我们为您精心构建并验证了基于pET28a载体的重组大肠杆菌表达系统——pET28a-EGFP。该系统将增强型绿色荧光蛋白（EGFP, Enhanced GFP） 基因高效整合，是您进行蛋白表达、纯化验证、教学演示及荧光标记研究的理想选择。

pET28a-EGFP重组大肠杆菌的核心优势

1. 强效可控表达：

   • 载体核心：pET28a是经典的大肠杆菌表达载体，核心是其强大的T7 lac 启动子系统。

   • 精确诱导：在未诱导状态下（无IPTG），表达被严格抑制（由lac阻遏蛋白实现）。加入诱导剂IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷） 后，T7 RNA聚合酶（通常由宿主菌如BL21(DE3)提供）被激活，高效转录EGFP基因。

   • 高效表达：T7启动子驱动能力极强，可实现EGFP蛋白的高水平表达。

2. 便捷纯化标签：

   • 融合标签：pET28a载体在EGFP基因的N端（有时也可能在C端，需确认具体构建）融合了6xHis标签（六个组氨酸残基）。

   • 亲和纯化：His标签能与镍离子（Ni²⁺）发生特异性螯合作用。利用镍柱亲和层析（Ni-NTA亲和层析），可快速、高效、温和地从复杂的细菌裂解液中一步纯化出高纯度的EGFP蛋白。

3. 直观可视报告：

   • 绿色荧光：成功表达的EGFP蛋白在蓝光（~488 nm）或紫外光（~395 nm） 激发下，会发出明亮的绿色荧光（发射峰~509 nm）。

   • 实时监测：该特性使得整个表达过程（诱导前后对比）、细菌生长状态、蛋白可溶性（是否形成包涵体）、纯化效果（收集的组分）都可通过荧光显微镜、凝胶成像系统或荧光分光光度计进行直观、快速的监测和评估，极大简化了实验流程。

4. 成熟稳定：

   • 该系统经过广泛验证，技术成熟，重复性好，是实验室常用的标准模型系统之一。

pET28a-EGFP大肠杆菌的提取与培养流程概要

智立中特(武汉)生物科技有限公司 提供的pET28a-EGFP菌株通常以甘油菌形式保存。以下是其复苏、扩增、诱导表达及蛋白提取纯化的关键步骤：

1. 菌种复苏与活化：

   • 取适量甘油菌，划线接种于含有卡那霉素（Kanamycin, Kan） 的LB固体平板上（pET28a载体带有Kan抗性基因）。37°C倒置培养过夜（12-16小时）。

   • 挑取单菌落，接种于含Kan的LB液体培养基中，37°C， 200-250 rpm振荡培养过夜（作为种子液）。

2. 扩大培养与诱导表达：

   • 将过夜种子液以1:50至1:100的比例转接到新鲜的、含Kan的LB液体培养基中。

   • 37°C， 200-250 rpm振荡培养至对数生长中期（OD₆₀₀ ≈ 0.4 - 0.6）。此阶段细菌生长旺盛，是诱导表达的黄金窗口。

   • 加入IPTG至终浓度0.1 - 1.0 mM（常用0.5 mM，可优化）。降低培养温度（通常至25-30°C）有助于提高可溶性蛋白比例，减少包涵体形成。

   • 诱导培养3-6小时（或过夜，根据实验需求优化）。诱导期间或结束后，可在蓝光激发下观察培养液是否呈现绿色荧光，初步判断表达情况。

3. 菌体收获：

   • 将诱导后的培养液转移至离心管。

   • 4°C, 4000-6000 x g 离心 10-20分钟，弃上清，收集菌体沉淀。可称重记录湿菌重量。

4. 细胞裂解：

   • 用预冷的裂解缓冲液（通常含Tris-HCl pH 8.0, NaCl, 咪唑，蛋白酶抑制剂如PMSF）重悬菌体沉淀。

   • 采用物理或化学方法破碎细胞：

     • 超声破碎：冰浴中进行，设置合适功率和循环次数（如：功率30%， 超声3秒，间隔5秒，总时长3-5分钟），至菌液变清亮、粘稠度下降。

     • 酶解法/化学法：如溶菌酶处理结合反复冻融或去垢剂。

   • 4°C, 12000-16000 x g 离心 20-30分钟，分离上清（可溶组分，含可溶性EGFP）和沉淀（不溶组分，主要为包涵体）。上清即为粗提物。

5. EGFP蛋白纯化（镍柱亲和层析）：

   • 将含His标签蛋白的上清液小心上样到已用平衡缓冲液（同裂解缓冲液，含低浓度咪唑如20mM）平衡好的Ni-NTA亲和层析柱。

   • 用清洗缓冲液（含较高浓度咪唑如30-60mM）洗去非特异性结合的杂蛋白。

   • 用洗脱缓冲液（含高浓度咪唑如250-500mM）洗脱特异性结合的His-EGFP融合蛋白。收集洗脱峰（通常为绿色）。

   • 对纯化后的EGFP蛋白进行缓冲液置换/脱盐（如使用PD-10柱或透析），去除高浓度咪唑和盐分，置换到适合储存或下游应用的缓冲液（如PBS, Tris-HCl）。

   • 纯度鉴定：通过SDS-PAGE电泳分析纯化前后样品，确认EGFP条带大小（约27 kDa）及纯度。

   • 浓度测定：使用Bradford法、BCA法或Nanodrop（利用280nm吸光度，EGFP有特征吸收峰）测定蛋白浓度。

   • 荧光活性验证：使用荧光分光光度计检测激发光谱和发射光谱，确认其荧光特性。

应用价值

• 分子生物学教学示范： 完美展示基因克隆、重组蛋白诱导表达、亲和层析纯化、SDS-PAGE、荧光检测等核心实验技术。

• 蛋白表达纯化系统验证： 作为阳性对照，测试新宿主菌株、新纯化方法或新表达条件的效率。

• 荧光标记与示踪研究基础： 为构建更复杂的融合蛋白（如目标蛋白-EGFP）提供基础元件和研究模型。

• 药物筛选与报告基因系统： 可用于构建基于荧光强度的报告系统。

智立中特(武汉)生物科技有限公司的承诺

我们提供的pET28a-EGFP大肠杆菌菌株，经过严格的质量控制，确保其活力、纯度和表达性能。我们同时可提供配套的实验方案详细指南、关键试剂（如优化的裂解/结合/洗脱缓冲液配方）及技术支持，助您的研究事半功倍。

选择智立中特，选择高效与可靠！让我们携手，用绿色荧光点亮您生命科学探索的精彩旅程！