智立中特技术分享：MNT-1人黑色素瘤细胞介绍与高效复苏培养指南

MNT-1细胞：解码黑色素瘤研究的璀璨模型

作为黑色素瘤研究领域的明星细胞系，MNT-1人黑色素瘤细胞因其高色素含量和稳定表达黑色素体相关蛋白（如Pmel17、MART-1、酪氨酸酶） 的特性而备受青睐。该细胞系源自一位转移性黑色素瘤患者的淋巴结，保留了在体外合成、储存并转运黑色素体的关键能力，是研究黑色素生成、黑色素体生物学、黑色素瘤转移机制及药物筛选的理想体外模型。

成功复苏：激活MNT-1细胞活力的关键第一步

规范的复苏操作是确保细胞实验顺利开展的基础。请遵循以下步骤进行MNT-1细胞的复苏与初期培养：

一、 实验前准备

1. 预热培养基： 使用含10%优质胎牛血清（FBS） 和1%青霉素-链霉素双抗的DMEM高糖培养基，于37℃水浴或培养箱中预热至少30分钟。

2. 预热试剂： 将适量PBS缓冲液和0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液置于37℃水浴预热。

3. 清洁工作台： 开启超净工作台紫外灭菌30分钟，关闭紫外灯后通风10分钟，用75%乙醇擦拭台面。

4. 恒温水浴： 准备37℃恒温水浴锅（水位需浸没冻存管液面）。

5. 仪器准备： 离心机预冷至4℃。

6. 耗材准备： 无菌冻存管架、移液器、吸头、15ml无菌离心管、25cm²培养瓶（T25）、废液缸等。

二、 细胞复苏流程（快速操作，避免反复冻融！）

1. 安全防护： 佩戴手套和护目镜，自液氮罐或-150℃超低温冰箱中迅速取出目标MNT-1细胞冻存管（确认标识无误）。

2. 快速解冻： 立即将冻存管浸入37℃水浴，轻柔摇晃加速融化（1-2分钟内完成，至管内仅剩微小冰晶时即止）。

3. 消毒转移： 用75%乙醇彻底擦拭冻存管外壁，移入超净台。

4. 稀释DMSO： 用1ml移液器轻柔吸取管内细胞悬液，转移至含5-7ml预热完全培养基的15ml离心管中，吹打混匀（稀释冻存液中的DMSO，降低其毒性）。

5. 离心去冻存液： 盖紧离心管盖，平衡后放入预冷离心机，4℃， 200 x g 离心5分钟。

6. 去上清： 离心后小心移去上清液（含冻存液），避免触碰管底细胞团块。

7. 重悬细胞： 向细胞沉淀中加入1ml预热完全培养基，用移液器轻柔吹打（约10-15次），形成均匀单细胞悬液（避免剧烈吹打产生气泡）。

8. 接种培养： 将细胞悬液转移至含4-5ml预热完全培养基的T25培养瓶中，轻柔晃动培养瓶使细胞分布均匀。

9. 标记培养： 在瓶身清晰标记细胞名称（MNT-1）、代数（如P0）、接种日期、操作者姓名。

10. 培养启动： 将培养瓶平稳放入37℃、5% CO₂、饱和湿度的培养箱中。

三、 复苏后培养观察与管理

1. 次日观察： 复苏后约24小时，在显微镜下观察细胞贴壁情况（应部分或大部分贴壁）、形态（典型上皮样，可含深色颗粒）及密度。

2. 首次换液： 复苏后24-48小时进行首次全量换液（小心吸去旧培养基，沿瓶壁缓慢加入5ml新鲜预热完全培养基），去除残留DMSO、死细胞碎片及代谢废物。

3. 后续换液： 此后每2-3天全量换液一次，保持营养充足。

4. 汇合度监控： 密切监测细胞生长，当细胞汇合度达到80%-90%（通常需3-5天）时即可进行传代。

四、 关键注意事项

• 快速化冻： 是保障细胞活率的核心，务必严格控制水浴时间。

• 轻柔操作： 吹打、离心等步骤需轻柔，最大限度减少机械损伤。

• DMSO去除： 充分稀释与离心去除DMSO至关重要。

• 无菌规范： 全程严格无菌操作，严防污染。

• 环境稳定： 确保培养箱温度、CO₂浓度及湿度恒定精准。

五、 常见问题解答

• Q: 复苏后细胞不贴壁或大量死亡？
  A: 重点排查化冻是否过慢、冻存细胞状态是否良好、冻存液是否失效、操作是否过于剧烈、培养基/血清是否异常。

• Q: 复苏后生长缓慢？
  A: 检查细胞密度是否过低、培养基/血清是否合适有效、培养箱环境是否达标、是否存在隐性污染。

• Q: 冻存管在水浴中破裂或渗漏？
  A: 立即停止操作，按生物安全规范处理污染物，彻底消毒工作区，更换冻存管。

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