精准操控细胞命运：TE-1食管鳞癌细胞株规范操作指南

         TE-1 细胞株是研究人食管鳞状细胞癌 (ESCC) 的重要体外模型，广泛应用于肿瘤发生机制、药物敏感性、基因功能及侵袭转移等研究领域。稳定可靠的细胞复苏与培养技术是保证实验数据准确性和可重复性的基石。本文旨在为智立中特（武汉）生物科技有限公司的科研人员提供一套规范、高效的 TE-1 细胞复苏与培养操作流程。

一、 实验材料准备

1. 细胞来源： TE-1 人食管鳞癌细胞株冻存管 (液氮长期冻存)。

2. 培养基： RPMI-1640 培养基 (含 2mM L-谷氨酰胺)。

3. 血清： 优质胎牛血清 (Fetal Bovine Serum, FBS)，推荐使用经灭活处理的。

4. 添加剂： 青霉素-链霉素双抗溶液 (100X, 终浓度 100 U/mL 青霉素，100 μg/mL 链霉素)。

5. 消化液： 0.25% (w/v) 胰蛋白酶-EDTA 溶液。

6. 缓冲液： D-PBS (无钙镁离子磷酸盐缓冲液)。

7. 冻存液： 细胞冻存液 (通常含 90% FBS + 10% DMSO)。

8. 耗材：

   • 75 cm² 细胞培养瓶 (T-75)

   • 15mL / 50mL 无菌离心管

   • 无菌巴氏吸管

   • 细胞计数板/自动细胞计数仪

   • 一次性无菌手套、实验服

9. 仪器：

   • 37°C, 5% CO₂ 恒温恒湿细胞培养箱

   • 生物安全柜 (超净工作台)

   • 倒置相差显微镜

   • 37°C 恒温水浴锅

   • 低速离心机 (可制冷更佳)

   • 液氮罐 (用于细胞存取)

二、 操作流程

A. TE-1 细胞复苏

1. 准备：

   • 预热：将水浴锅预热至 37°C。将完全培养基 (RPMI-1640 + 10% FBS + 1% Penicillin-Streptomycin) 置于 37°C 水浴或培养箱中预热至少 30 分钟。

   • 消毒：开启生物安全柜紫外灯照射 30 分钟，通风 10 分钟后开始操作。用 75% 酒精彻底擦拭台面及所有将要放入的物品。

   • 标记：准备一个 15mL 无菌离心管，加入约 9mL 预热好的完全培养基。标记好培养瓶 (如：TE-1, 复苏日期)。

2. 取出冻存管：

   • 佩戴防冻手套和面罩，迅速从液氮罐中取出目标 TE-1 细胞冻存管。⚠️ 注意： 操作液氮务必小心冻伤，避免冻存管因温差剧烈变化而爆炸。

   • 立即 将冻存管放入 37°C 水浴锅中，轻轻、持续地摇晃，使其在 1-2 分钟内完全融化。⚠️ 关键： 融化过程要快，避免 DMSO 在常温下对细胞产生毒性。勿使水没过冻存管盖。

3. 转移与清洗：

   • 融化后，立即用酒精棉球彻底擦拭冻存管外壁消毒。

   • 在生物安全柜内，用无菌巴氏吸管将冻存管内细胞悬液 轻柔地 转移至步骤 1 准备好的装有 9mL 完全培养基的 15mL 离心管中。此步骤可稀释去除残留的 DMSO。

   • 吸管轻轻吹打混匀。

4. 离心：

   • 盖紧离心管盖，放入预冷至 4°C 的离心机中。

   • 以 1000 rpm (约 150-200 × g) 离心 5 分钟。

5. 重悬与接种：

   • 离心后，在生物安全柜内小心弃去上清液，避免触及细胞沉淀。

   • 加入 1-2mL 预热的完全培养基，用吸管 轻柔吹打 (避免产生过多气泡)，使细胞沉淀充分重悬成单细胞悬液。

   • 将细胞悬液转移至标记好的 T-75 培养瓶中。

   • 补充完全培养基至总体积约 15mL (覆盖瓶底即可)。

   • 盖紧瓶盖，轻柔地前后左右十字晃动 培养瓶数次，使细胞均匀分布。

6. 培养：

   • 将培养瓶平稳放入 37°C, 5% CO₂ 的恒温恒湿培养箱中。

   • 复苏后 24 小时内不宜移动或观察，让细胞充分贴壁。

B. TE-1 细胞培养与传代

1. 日常观察：

   • 复苏 24 小时后，在倒置相差显微镜下观察细胞状态：

     • 贴壁情况： 细胞应大部分贴壁（TE-1 为贴壁细胞）。

     • 形态： 健康的 TE-1 细胞通常呈上皮样，多边形，铺路石状排列，折光性好，轮廓清晰。

     • 密度： 评估细胞汇合度 (Confluency)。当细胞生长至约 80%-90% 汇合度 时，是传代的最佳时机。避免过度生长导致接触抑制或状态变差。

     • 污染： 检查培养基是否清亮，有无漂浮物、菌丝、异常 pH 变化（培养基颜色异常发黄或发紫）。

2. 更换培养基：

   • 根据细胞生长速度和培养基颜色变化 (通常 2-3 天)，及时更换新鲜完全培养基。弃去旧培养基，加入适量 (约 10-15mL) 预热的完全培养基。

3. 传代 (消化)：

   • 准备： 预热胰酶、完全培养基、D-PBS。标记好新培养瓶。

   • 清洗： 弃去旧培养基。加入 5-10mL 无菌 D-PBS，轻轻晃动清洗细胞表面残留的血清（血清会抑制胰酶活性），弃去 PBS。

   • 消化： 加入 1-2mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液 (覆盖瓶底即可)，轻轻晃动使液体覆盖所有细胞。放入 37°C 培养箱中孵育 1-3 分钟。

   • 观察： 在显微镜下密切观察。当 大部分细胞变圆、边缘折光性增强、有少量细胞开始漂浮时 (通常在 1-3 分钟内，具体时间需摸索)，立即终止消化。⚠️ 关键： 避免过度消化损伤细胞。

   • 终止： 加入 5-10mL 预热的 完全培养基 (内含 FBS 可中和胰酶)，用吸管 轻柔但彻底地 反复吹打瓶壁，将贴壁细胞完全吹打下来，形成单细胞悬液。吹打时注意避免产生过多气泡。

   • 转移与离心： 将细胞悬液转移至 15mL 离心管中。1000 rpm (约 150-200 × g) 离心 5 分钟。

   • 重悬与接种：

     • 弃去上清液。

     • 加入适量新鲜完全培养基 (体积根据传代比例和培养瓶大小确定)，轻柔吹打重悬细胞。

     • 进行细胞计数 (推荐使用自动细胞计数仪或血球计数板)。根据实验需求按合适密度接种到新的培养瓶中。常规传代比例建议 1:3 至 1:6 (即一个长满的 T-75 瓶细胞分到 3-6 个新的 T-75 瓶中)。例如：计数后，按 0.8-1.5 × 10⁵ cells/mL 的密度接种，T-75 瓶加入 15mL 培养基。

     • 十字晃动混匀。

   • 培养： 放回培养箱。传代后 24 小时可观察贴壁情况。

C. TE-1 细胞冻存 (简要)

当需要保存细胞或细胞状态良好且数量充足时，可进行冻存。

1. 消化收集： 按传代步骤消化收集处于对数生长期的 TE-1 细胞，离心。

2. 配制冻存液： 弃上清，用预冷的细胞冻存液 (如 90% FBS + 10% DMSO) 重悬细胞。细胞密度是关键，建议在 5×10⁶ 至 1×10⁷ cells/mL。

3. 分装： 迅速将细胞悬液分装至标记好的冻存管中 (细胞株名称、代次、冻存日期、操作者)。

4. 程序降温： 使用程序降温盒 (如 Mr. Frosty) 或可控降温仪，按标准程序 (通常 -1°C/min) 降至 -80°C 过夜 (12-24 小时)。

5. 液氮保存： 次日必须 将冻存管迅速转移至液氮气相或液相中长期保存。⚠️ 重要： 避免在 -80°C 长期存放。

三、 关键注意事项与常见问题

1. 无菌操作： 全程严格遵守无菌操作规范，所有操作在生物安全柜内进行，穿戴好个人防护装备。这是防止污染的核心。

2. 温度控制：

   • 复苏时水浴温度必须准确为 37°C，融化要快。

   • 培养基、胰酶、PBS 使用前需预热至 37°C (水浴或温箱)。

   • 离心最好在 4°C 进行。

   • 冻存细胞转移至液氮要迅速。

3. 胰酶消化： 这是最易出问题的步骤。务必在显微镜下密切监控，消化时间宁短勿长。不同批次胰酶活性或细胞状态不同可能影响时间。加入含血清培养基后要彻底吹散细胞团块。

4. 细胞状态监控：

   • 形态： 定期镜下观察，熟悉健康 TE-1 细胞的形态。出现空泡、颗粒增多、拉丝、漂浮死细胞增多均提示状态不佳。

   • 生长速度： 记录传代时间和汇合度，建立稳定的生长曲线。生长突然变慢可能预示污染、老化或培养条件问题。

   • 培养基颜色： RPMI-1640 含酚红指示剂，正常为红色或橙红色。过度变黄 (酸性，代谢废物多) 或变紫 (碱性，通常因污染) 均需警惕。

5. 污染处理： 一旦怀疑或确认污染 (细菌、真菌、支原体)，立即废弃 该批次所有细胞及接触过的培养基、试剂，彻底清洁培养箱和工作台，重新复苏冻存细胞。不要试图挽救。

6. 代数控制： 长期传代可能导致细胞遗传漂变或特性改变。建议使用低代次细胞 (如 P10 以内) 进行关键实验，并定期从原始冻存管复苏。

7. DMSO 毒性： 复苏后离心洗涤步骤对去除残留 DMSO 很重要。冻存时 DMSO 浓度务必准确 (通常 10%)。

8. 冻存细胞质量： 冻存应在细胞状态最佳 (对数生长期，高活力)、高密度下进行。程序降温对细胞存活率至关重要。

四、 总结

熟练掌握 TE-1 人食管癌细胞的复苏、培养、传代及冻存技术，是保障相关肿瘤研究顺利进行的基础。关键在于细节的把控：严格无菌、精准控温、适度消化、密切观察、及时传代/换液、规范冻存。智立中特（武汉）生物科技有限公司的科研人员遵循本指南，结合实践经验的积累，定能高效稳定地培养 TE-1 细胞，为食管癌研究提供可靠的细胞模型。