实验室微生物样品的取样方法与取样要求及核心原则！

　　微生物样品的取样是微生物检测的关键第一步，直接影响结果的准确性和可靠性。不规范的取样会导致整个检测过程失去意义。以下详细说明微生物样品的取样方法及要求：

　　一、核心原则

　　1、无菌原则：这是微生物取样的首要原则。整个取样过程必须防止样品被外源微生物污染，同时也要防止样品中的微生物污染环境或人员。

　　2、代表性原则：所取样品必须能代表被检测的整批物料、环境或特定目标区域。

　　3、及时性原则：取样后应尽快进行检测或采取适当措施（如低温保存）抑制微生物生长/死亡，保证样品在检测前的状态尽可能接近取样时。

　　4、安全性原则：取样人员需做好个人防护，避免被病原微生物感染，同时防止样品泄露污染环境。对于已知或疑似高致病性微生物样品，需在相应生物安全级别下操作。

　　5、可追溯性原则：详细记录取样信息，确保样品可追溯。

　　二、取样前准备

　　1、制定取样计划：

　　明确检测目的（如：常规监测、污染调查、验证等）。

　　确定取样对象（水、食品、药品、环境表面、空气、临床标本等）。

　　根据检测标准、法规要求或研究目的，确定取样点、取样量、取样频率、取样方法。

　　进行合理的抽样设计（随机抽样、分层抽样、系统抽样等），确保代表性。

　　2、准备取样工具和容器：

　　无菌：所有直接接触样品的工具（如取样勺、镊子、剪刀、注射器、吸管、拭子）和容器（如样品袋、样品瓶、试管）必须预先灭菌（常用干热、湿热、辐照灭菌法），并在无菌状态下运输和开启。

　　适用性：材质应对微生物无毒、不吸附目标微生物（如塑料优于玻璃，尤其对于病毒）。容器应密封良好，防渗漏。

　　标签：准备防水、不易脱落的标签。

　　保护套/包装：用于保护无菌取样工具（如注射器针帽、无菌袋）。

　　3、准备运输容器：

　　根据样品特性和检测项目要求，准备保温箱（冷藏箱或保温箱），内置足够的冷冻剂（冰袋、干冰等）或温度维持材料，确保样品在运输过程中维持规定的温度（通常0-4°C冷藏，特殊样品如病毒可能需-70°C或液氮）。

　　运输容器应坚固、防震、防漏。

　　4、准备记录表格：设计并打印好取样记录单。

　　5、人员准备：

　　取样人员需经过培训，熟悉取样程序、无菌操作技术和安全防护要求。

　　穿戴适当的个人防护装备：无菌手套、口罩、帽子、防护服（必要时穿无菌服）、护目镜（必要时）等。进入洁净区需遵守更严格的更衣程序。

　　手部清洁与消毒：取样前必须彻底洗手，并用75%酒精或其他有效消毒剂消毒双手。更换手套时需重新消毒手。

　　三、取样方法（根据样品类型）

　　1、液体样品(水、饮料、液态奶、尿液、体液等)：

　　方法：充分混匀样品（避免产生气泡）。用无菌注射器、移液器或虹吸装置吸取规定体积。对于开放水体，应在规定深度取样。

　　容器：无菌玻璃瓶或塑料瓶（带螺旋盖或密封垫）。

　　要求：取样时避免接触容器口及内壁。瓶内留适当顶空（约10%）。某些检测（如挥发性酸）需装满无顶空。水样检测余氯时，取样瓶需提前加入硫代硫酸钠中和余氯。

　　2、固体或半固体样品(食品、土壤、粪便、组织、药膏等)：

　　方法：

　　无菌勺/镊子/刀：在样品不同部位多点取样，混合后取代表性部分装入无菌袋或瓶中。对于大块样品，需先无菌切开，取内部和表面部分。

　　均质法：将定量样品（如25g）加入含适量无菌稀释液（如缓冲蛋白胨水）的无菌均质袋中，用拍打式均质器拍打1-2分钟，制成均匀的1:10初始悬浮液，用于后续检测。此法最常用，分散效果好。

　　研磨法：少量坚硬样品可在无菌研钵中研磨后转移。

　　拭子法(表面取样)：见下文。

　　容器：无菌广口瓶、无菌密封袋（带滤膜或均质袋）。

　　要求：确保工具足够深入取样点，保证代表性。避免样品在取样过程中融化或温度升高。

　　3、表面样品(设备、器具、工作台、手部等)：

　　方法：

　　接触碟法：将装有固体培养基的平皿直接压触在平整表面规定时间（通常10-60秒），盖上盖子培养。适用于平整规则表面。

　　棉拭子/海绵拭子法：

　　用无菌拭子蘸取适量无菌稀释液或转运液，在规定的取样面积内用力、均匀擦拭，水平、垂直方向反复多次。

　　将拭子头剪入或直接放入含适量无菌稀释液/转运液的试管中，充分振荡洗脱。

　　海绵拭子适用于大表面或不平整表面，吸附量更大。

　　冲洗法：向设备腔体（如管道、罐）内注入定量无菌稀释液，充分震荡或循环冲洗，收集冲洗液作为样品。

　　要求：明确标示取样区域。接触碟法需确保培养基表面完全接触。拭子法需保证擦拭力度、覆盖面和湿润度。

　　4、空气样品：

　　方法：

　　沉降碟法(被动沉降)：将装有固体培养基的平皿打开，在规定高度和位置暴露规定时间（通常30分钟至4小时），盖上盖子培养。计算沉降菌落数。

　　撞击法(主动采样)：使用空气采样器（如裂隙式、离心式、液体冲击式），将空气以一定流速撞击到培养基表面或液体中，捕获空气中的粒子。结果以CFU/m³表示。

　　要求：根据洁净级别要求选择方法。采样点、高度、时间、流量需按标准设定。避免气流干扰。

　　5、临床标本(痰、脓液、血液、脑脊液等)：

　　方法：严格遵守无菌操作和生物安全规范。由专业医护人员采集。

　　血液/体液：无菌穿刺采集，注入无菌血培养瓶（需氧/厌氧）或试管。

　　痰液：指导患者深咳取清晨痰。

　　拭子(咽拭子、鼻拭子、伤口拭子)：使用专用转运拭子，在病灶处用力旋转涂抹。

　　容器：专用无菌容器、血培养瓶、含转运介质的拭子管。

　　要求：采集时机（如用药前）、部位、方法对结果影响极大。需快速送检，某些样品需保温。

　　四、取样要求（关键控制点）

　　1、无菌操作：

　　取样环境应尽可能清洁（在超净工作台或生物安全柜内进行最佳）。

　　开启无菌容器前，用75%酒精擦拭外表面。

　　无菌工具和容器只能接触样品，避免触碰非无菌表面。

　　取样过程中动作迅速、准确，尽量减少样品在空气中的暴露时间。

　　2、防止交叉污染：

　　不同样品或不同取样点之间，必须更换无菌工具和手套。

　　避免取样工具接触容器口。

　　3、样品标识：

　　立即在容器上粘贴牢固标签，清晰标注（至少包含）：

　　样品唯一编号

　　样品名称/描述

　　取样日期和时间

　　取样地点/具体位置

　　取样人

　　检测项目（如适用）

　　任何特殊处理（如添加中和剂）

　　填写详细的取样记录单（包括以上信息及环境条件如温度、湿度等）。

　　4、样品量：必须满足检测方法要求的最小量，并考虑可能的复测需求。

　　5、温度控制：

　　对温度敏感的样品（绝大多数微生物样品），取样后应立即放入预冷的保温箱（0-4°C），在运输和储存过程中维持冷藏（除非特定微生物要求在室温或更高温度下运输，如某些寄生虫）。

　　冷冻样品应保持冷冻状态（通常-18°C以下，特殊要求如-70°C）。

　　记录取样时样品温度（如可能）和运输过程中的温度。

　　6、密封性：确保容器密封良好，防止泄漏、污染和水分蒸发。

　　7、运输时限：取样后应尽快送抵实验室。通常要求冷藏样品在24-48小时内检测。具体时限依据样品类型、检测项目、保存条件和标准要求确定。某些样品（如病毒、厌氧菌）要求更短时限。

　　8、运输条件：使用合适的运输容器和足够的冷冻剂，确保温度符合要求。运输过程应避免剧烈震荡、阳光直射。符合生物安全要求的样品需三层包装（主容器、辅助容器、外包装），并附有运输文件。

　　五、特殊考虑

　　厌氧菌取样：需使用专门的无氧转运装置或培养基，尽量减少样品暴露于空气的时间。

　　病毒取样：通常使用专用病毒转运培养基，严格低温（干冰或液氮）保存运输。

　　挥发性样品：容器应装满无顶空。

　　高酸/高碱/高渗样品：取样后可能需要立即中和或调节渗透压。

　　辐照/辐解敏感样品：避免使用辐照灭菌的容器（如必须，需验证无影响）。

　　六、取样记录

　　必须详细、准确、及时地记录所有取样信息，至少包括：

　　取样计划编号/名称

　　样品编号

　　样品名称和描述

　　取样日期和时间

　　精确的取样地点（如设备编号、房间号、坐标、深度等）

　　取样方法

　　取样量

　　取样人

　　环境条件（温度、湿度等）

　　观察到的任何异常情况

　　使用的取样工具和容器类型

　　保存方式和运输要求

　　预定检测项目

　　记录应清晰、不易涂改，并妥善保存。

　　七、常见错误

　　未遵循无菌操作，导致污染。

　　取样点/方法不具有代表性。

　　样品量不足。

　　标识不清或错误。

　　容器选择不当或未灭菌。

　　未及时冷藏或冷冻。

　　运输时间过长或温度失控。

　　记录不完整或不准确。

　　个人防护不到位。

　　总结：微生物取样是一项技术性很强的工作，必须严格遵守无菌原则、代表性原则和相关的标准操作规程(SOP)。充分的准备、规范的操作、准确的记录和适当的保存运输是保证后续微生物检测结果准确可靠的前提。务必根据具体的样品类型和检测目的，参考相应的国家标准、行业标准、药典或企业内部规定进行操作。记住：垃圾进（取样不规范），垃圾出（结果不可靠）。

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