pRS304-TEF1-MCS：解锁酵母高效表达的基因工程钥匙

一、质粒概述

pRS304-TEF1-MCS 是一种广泛应用于酵母遗传操作的穿梭质粒，具有以下核心特性：

• 骨架：基于 pRS304（TRP1 标记，酵母染色体整合载体）。

• 启动子：搭载强组成型启动子 TEF1（翻译延伸因子），驱动外源基因在酵母中持续高效表达。

• 多克隆位点（MCS）：提供多酶切位点，便于目标基因的灵活插入。

• 筛选标记：

  • 酵母端：TRP1（色氨酸合成基因，用于色氨酸缺陷型酵母筛选）。

  • 细菌端：Amp^R（氨苄青霉素抗性，便于大肠杆菌扩增）。

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二、操作流程与技术要点

1. 质粒提取（从大肠杆菌）

步骤：

1. 培养：接种含 pRS304-TEF1-MCS 的 E. coli（如 DH5α）至 LB + Amp (100 μg/mL) 培养基，37℃振荡培养 12–16 小时。

2. 提取：使用商业质粒提取试剂盒（如 Qiagen Miniprep）进行小量提取，推荐 碱裂解法。

3. 质控：通过琼脂糖凝胶电泳、Nanodrop 检测浓度/纯度，酶切或测序验证结构完整性。

✅ 关键提示：若从酵母中回收质粒，需先用 酵母质粒提取试剂盒（含破壁步骤），再转化至 E. coli 扩增。

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2. 宿主菌培养

适用宿主：

• 酵母：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）TRP1 缺陷株（如 BY4741 trp1Δ）。

• 细菌：大肠杆菌（E. coli DH5α 等）用于质粒扩增。

培养条件：

⚠️ 注意事项：

• 酵母培养需 充分通气（摇床转速 ≥200 rpm）；

• 避免长时间培养（>48 h），防止质粒丢失；

• 定期划线分离单菌落，维持筛选压力。

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3. 质粒保藏

🔒 保藏要点：

• 甘油菌需分装，避免反复冻融；

• 定期验证质粒稳定性（如平板筛选、PCR检测）。

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三、实验中的特别注意事项

1. 启动子泄漏控制：
   TEF1 为强启动子，若表达毒性蛋白，建议使用 诱导型启动子 替代或采用条件突变株。

2. 酵母转化效率：

   • 使用高转化效率方法（如 LiAc/SS-DNA/PEG 法）；

   • 感受态细胞需处于对数生长期（OD₆₀₀ ≈ 0.8–1.0）。

3. 质粒稳定性：

   • 在无选择压力下传代时，酵母易丢失质粒，务必在 SD/-Trp 中维持培养。

4. 基因插入方向：

   • 克隆至 MCS 后，需通过酶切图谱或测序确认插入方向正确。

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四、核心应用场景

pRS304-TEF1-MCS 凭借其 高效表达+稳定整合 特性，适用于：

1. 酵母蛋白生产：

   • 外源酶、抗体片段、代谢途径酶的组成型表达。

2. 代谢工程研究：

   • 构建酵母细胞工厂（如生物燃料、药物前体合成）。

3. 启动子功能分析：

   • 替换 TEF1 研究不同启动子强度（通过报告基因如 lacZ）。

4. 基因功能互补：

   • 在 trp1Δ 酵母中回补 TRP1 功能或表达靶基因。

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结语

pRS304-TEF1-MCS 是酵母遗传改造的可靠工具，兼具 操作便捷性 与 表达高效性。智立中特（武汉）生物科技有限公司提供该质粒的 高纯度克隆产品 及 定制化服务（如基因插入、载体改造），助力您的合成生物学与分子生物学研究！