pBAD-Myc-HisB：掌握高效克隆、表达与纯化的关键

     在分子生物学和蛋白质研究领域，高效、可控地表达目标蛋白是实验成功的关键。pBAD-Myc-HisB 载体系统正是为此而设计的强大工具，尤其适用于在大肠杆菌（E. coli）宿主中表达重组蛋白。智立中特(武汉)生物科技有限公司为您深入解析这一经典载体，助您掌握其应用精髓。

一、 pBAD-Myc-HisB 载体概览

pBAD-Myc-HisB 是一种基于阿拉伯糖（arabinose）诱导调控的细菌表达载体。其核心特点在于：

1. 严格调控的启动子 (araBAD promoter)： 受阿拉伯糖精确控制。无阿拉伯糖时，表达被强烈抑制（本底表达极低）；加入阿拉伯糖后，表达高效诱导。这种“开关式”调控对于表达有毒蛋白或需要精确控制表达水平的实验至关重要。

2. 双标签融合 (Myc & His)：

   • Myc 表位标签 (c-Myc epitope tag)： 位于多克隆位点（MCS）上游，便于使用抗Myc抗体进行免疫检测（如Western Blot, 免疫荧光）。

   • His6 标签 (Hexahistidine tag)： 位于蛋白C末端，极大地简化了利用固定化金属离子亲和层析（IMAC, 如 Ni-NTA, Co-NTA）进行蛋白纯化的过程。

3. 多克隆位点 (MCS)： 提供多个单一限制性酶切位点，方便插入目标基因。

4. pBR322 复制起点 (ori)： 保证载体在大肠杆菌中稳定复制。

5. 氨苄青霉素抗性 (AmpR)： 用于筛选含有载体的转化子。

二、 pBAD-Myc-HisB 的使用流程

1. 质粒提取 (Plasmid Extraction)

• 方法： 通常使用商业化质粒小量/中量/大量提取试剂盒（如基于碱裂解法）。

• 步骤简述：

  1. 培养含有 pBAD-Myc-HisB 质粒的大肠杆菌工程菌（如 TOP10）。

  2. 离心收集菌体。

  3. 试剂盒裂解液裂解细胞。

  4. 中和裂解液，使染色体DNA和蛋白质变性沉淀，质粒DNA留在上清。

  5. 上清过柱（硅胶膜），质粒DNA在高盐条件下结合到膜上。

  6. 洗涤去除杂质。

  7. 低盐缓冲液或水洗脱得到纯净的 pBAD-Myc-HisB 质粒DNA。

• 关键点： 操作需无菌，裂解时间不宜过长，洗脱液体积和温度影响最终浓度和得率。提取后需进行浓度测定（Nanodrop）和纯度检测（琼脂糖凝胶电泳）。

2. 宿主菌培养 (Host Cell Cultivation)

• 常用宿主菌： 推荐使用 ara 操纵子调控系统兼容且蛋白酶缺陷的菌株，如：

  • TOP10: 常用克隆菌株，适合质粒扩增和一般蛋白表达。

  • LMG194: 蛋白酶缺陷型 (Δlon ΔompT)，减少表达蛋白的降解，尤其适合表达不稳定蛋白。

  • BL21(DE3) pLysS (或其他变体)： 如果目标基因需要T7 RNA聚合酶（但pBAD是阿拉伯糖启动子，非T7，此菌株常用于共表达或特定需求），且pLysS提供氯霉素抗性和胞内溶菌酶以降低本底表达。注意： 使用 BL21(DE3) 系列时，需明确其T7系统不会干扰您的实验。

• 培养基： 富含营养的培养基，如 LB (Luria-Bertani) 或 2xYT。添加适当的抗生素（通常是 100 μg/mL 氨苄青霉素）维持质粒选择性压力。

• 培养条件：

  • 温度： 通常 37°C。对于表达易聚集或不溶的蛋白，可尝试 较低温度（如 25°C, 30°C） 诱导以提高可溶性。

  • 通气： 良好振荡（摇床）或通气（发酵罐），保证充足氧气供应。

• 诱导表达：

  1. 接种： 将含有pBAD-Myc-HisB质粒的单克隆接种到含Amp的培养基中，过夜培养 (约16-18小时)。

  2. 扩增： 按 1:50 至 1:100 的比例将过夜培养物转接到新鲜含Amp的培养基中。

  3. 生长至对数中期： 在37°C剧烈振荡下培养，直到 OD600 达到 0.5 - 0.8 (此阶段生长迅速，需密切监测)。

  4. 诱导： 加入无菌过滤的 L-(+)-阿拉伯糖 (L-Arabinose) 溶液至终浓度 0.0002% - 0.2% (w/v)。

     • 浓度选择至关重要！ 这是pBAD系统的核心优势也是易错点。

     • 起始建议： 常用浓度范围是 0.02% (0.2 g/L)。务必进行浓度梯度优化 (如 0.002%, 0.02%, 0.2%) 以找到目标蛋白的最佳表达量和可溶性的平衡点。浓度过高可能导致过度表达形成包涵体或抑制生长；过低则诱导不足。

  5. 诱导培养： 在适当温度（通常37°C或更低）下继续培养 3-6 小时 (或根据蛋白性质和实验需求优化时间)。

3. 质粒/菌种保藏 (Plasmid/Strain Preservation)

• 短期保藏 (质粒或菌液)：

  • 4°C： 含质粒的菌液在LB或2xYT培养基中（加有相应抗生素），可短期保存（几天到一周）。

  • -20°C： 纯化的质粒DNA溶于TE缓冲液或无菌水中，可保存数月到一年。加入甘油（终浓度50%）的菌液可在-20°C保存数周至数月（稳定性不如-80°C）。

• 长期保藏 (菌种)：

  • -80°C 甘油菌： 这是最推荐的方法。

    1. 取对数生长期的菌液（OD600≈0.6-1.0）。

    2. 加入无菌的50%甘油溶液（终浓度约15-20%甘油）。

    3. 充分混匀。

    4. 分装至无菌冻存管。

    5. 立即置于 -80°C 超低温冰箱保存。此法可保存数年甚至更久。

  • 冷冻干燥 (Lyophilization)： 更专业、长期保存的方法，但需要特殊设备。

• 关键点： 保藏前确保菌株纯度和质粒存在（抗生素平板验证）。标记清晰（菌株名称、质粒、抗性、日期等）。

三、 培养时需特别注意的地方 (Critical Considerations)

1. 阿拉伯糖浓度优化： 这是pBAD系统成功的关键！ 务必进行梯度实验 (如 0.002%, 0.02%, 0.2%)。最佳浓度因蛋白和菌株而异。浓度过高可能导致生长抑制或包涵体形成；过低则诱导不足。

2. 诱导时机 (OD600)： 在对数中期 (OD600 0.5 - 0.8) 诱导效果最佳。过早（细胞量少）影响最终产量；过晚（进入平台期）细胞活力下降，表达效率降低。

3. 诱导温度： 37°C 诱导最快，但可能导致包涵体形成。对于难溶蛋白，降低诱导温度 (25-30°C) 并延长诱导时间 (过夜或更长) 常能显著提高可溶性蛋白产量，尽管总表达量可能略低。

4. 诱导时间： 需优化。通常3-6小时足够，但某些蛋白可能需要更短或更长（甚至过夜）时间才能达到最佳表达量或正确折叠。

5. 宿主菌选择： 根据目标蛋白特性选择宿主菌。表达易降解蛋白时，务必使用蛋白酶缺陷型菌株（如LMG194）。克隆和质粒扩增首选TOP10等。

6. 抗生素浓度： 确保使用正确浓度的氨苄青霉素（通常100 μg/mL）以维持选择压力，防止质粒丢失。

7. 无菌操作： 所有步骤均需严格无菌操作，防止污染。

8. 生长监测： 密切监测OD600，确保在正确时机诱导。

9. 阿拉伯糖溶液： 使用无菌过滤的L-(+)-阿拉伯糖溶液（通常配成10-20%储存液），避免引入污染或热原。

四、 pBAD-Myc-HisB 的广泛应用

得益于其严格调控性和便捷的纯化/检测标签，pBAD-Myc-HisB 在科研和生物技术领域有着广泛用途：

1. 重组蛋白表达与纯化： 是最核心的应用，用于大量生产目标蛋白，特别是需要严格调控表达水平（如有毒蛋白）或需要快速纯化（His标签）的蛋白。

2. 蛋白-蛋白相互作用研究： 利用Myc或His标签，可通过免疫共沉淀（Co-IP）、Pull-down（如Ni-NTA Pull-down）等技术研究蛋白相互作用。

3. 抗体生产： 表达纯化的抗原蛋白（带标签）可用于免疫动物制备抗体。纯化过程（IMAC）可有效去除细菌杂蛋白。

4. 结构生物学研究： 表达用于X射线晶体学、核磁共振（NMR）或冷冻电镜（Cryo-EM）研究的蛋白样品。温度优化对获得可溶性、良好折叠的蛋白至关重要。

5. 酶学与功能研究： 表达具有催化活性的酶，用于酶动力学、抑制剂筛选等功能研究。

6. 药物靶点验证： 表达潜在的药物靶点蛋白，用于体外结合或活性筛选实验。

7. 蛋白定位研究： 利用抗Myc抗体进行免疫荧光（IF）或免疫组化（IHC），研究蛋白在细胞内的定位（需注意在细菌中通常用于表达，在真核细胞中定位研究需其他载体系统）。

8. 构建表达文库： 可用于构建基因文库并进行功能筛选。

总结：

       pBAD-Myc-HisB是一个功能强大且灵活的原核表达载体，其核心优势在于阿拉伯糖诱导的严格调控性和Myc/His双标签带来的便捷检测与纯化。智立中特(武汉)生物科技有限公司提醒您，成功使用该载体需要精细优化培养条件，特别是阿拉伯糖浓度、诱导时机和温度。选择合适的宿主菌（如TOP10用于克隆扩增，LMG194用于表达易降解蛋白）和规范的保藏方法（-80°C甘油菌）是实验可重复性的保障。掌握好这些要点，pBAD-Myc-HisB将成为您探索蛋白质功能、生产生物试剂和推进研发项目的得力助手。