Hep-3B细胞操作指南及注意事项

在探索肝癌奥秘、筛选抗癌药物、研究肿瘤发生发展机制的科学旅程中，Hep-3B人肝癌细胞扮演着至关重要的“守护者”角色。作为智立中特(武汉)生物科技有限公司，我们深知稳定可靠的细胞资源以及规范的操作是科研成功的基石。本文将带您全面了解Hep-3B细胞，并手把手教您如何进行细胞的“唤醒”（复苏）、“日常照料”（培养）和“冬眠保存”（冻存），最后总结那些关乎实验成败的“生命细节”。

第一部分：认识我们的“守护者” - Hep-3B人肝癌细胞

• 来源与身份： Hep-3B细胞来源于一位7岁的黑人男性肝细胞癌患者的组织。它是一种上皮样贴壁细胞，意味着它们喜欢“趴”在培养瓶/皿的底部生长。

• 核心价值：

  • 肝癌研究的经典模型： 广泛应用于肝癌的基础研究，如肿瘤增殖、侵袭转移、信号通路、基因功能、药物敏感性等。

  • 分泌甲胎蛋白： Hep-3B能分泌甲胎蛋白，这是肝癌诊断的重要生物标志物之一，使其成为研究AFP相关机制的理想模型。

  • HBV整合： 该细胞株基因组中整合有乙型肝炎病毒的部分序列，对于研究HBV相关肝癌的发病机制具有特殊价值。

  • p53缺失： Hep-3B细胞缺乏功能性p53蛋白（一种重要的肿瘤抑制蛋白），这一特性使其在癌症生物学研究中备受关注。

• 基本“习性”：

  • 培养基： 通常在DMEM或MEM培养基中生长良好。

  • 营养补充： 需要添加10%胎牛血清提供必需的生长因子和营养物质。

  • 环境： 喜欢37°C的温暖环境，空气中需要含有5% CO₂来维持培养基的酸碱度（pH值≈7.4）。

  • 生长速度： 生长速度中等偏快，需要定期传代（一般2-3天传代一次）。

  • 形态特征： 贴壁生长，显微镜下观察呈多边形或鹅卵石样，细胞间连接紧密。

第二部分：“唤醒”沉睡的细胞 - Hep-3B复苏操作指南

复苏是将冻存在液氮中的“冬眠”细胞恢复到活跃生长状态的关键第一步。快速、温和、无菌是核心原则。

1. 准备“温床”：

   • 预热完全培养基（如DMEM + 10% FBS）至37°C。

   • 准备好所需规格的培养瓶（如T25或T75）并做好标记（细胞名称、日期、操作者）。

   • 预热水浴锅至37°C，并确保水位能完全浸没冻存管液面以上。

   • 准备好15ml无菌离心管、移液器、枪头、废液缸、75%酒精喷壶等。

2. 快速“解冻”：

   • 安全防护： 戴上防护面罩和厚手套，从液氮罐中迅速取出目标Hep-3B细胞冻存管（尽量减少在空气中的暴露时间，避免管内外温差过大导致爆炸风险）。

   • 急速融化： 立即将冻存管放入37°C水浴锅中，轻柔地、不停地摇晃，直到冻存液完全融化（通常需要1分钟左右）。切记：融化过程务必迅速！

3. 去除“保护剂”：

   • 用75%酒精彻底擦拭冻存管外壁，移入生物安全柜/超净工作台。

   • 用无菌移液器将冻存管内的细胞悬液缓慢地滴加到含有5-10ml预热完全培养基的15ml离心管中（1:10到1:20稀释）。目的： 稀释对细胞有毒性的冻存保护剂DMSO，减少渗透压冲击。

4. 温和“清洗”：

   • 低速离心： 盖紧离心管盖，放入离心机，以200-300g左右的相对离心力离心5分钟。目的： 将细胞沉降下来，去除含有DMSO的上清液。

5. 重获“新生”：

   • 小心弃上清： 离心后，在生物安全柜内小心打开管盖，彻底弃去上清液（不要碰到管底的细胞团）。

   • 轻柔重悬： 向细胞团中加入1-2ml预热的新鲜完全培养基。用1ml移液器轻柔吹打（避免产生过多气泡），使细胞均匀分散成单细胞悬液。吹打次数不宜过多，防止机械损伤。

6. “安家落户”：

   • 将细胞悬液均匀转移到标记好的培养瓶中。

   • 根据培养瓶大小（如T25瓶加入5ml，T75瓶加入10-15ml），补充适量的预热完全培养基，轻轻摇晃培养瓶使细胞分布均匀。

   • 放入培养箱： 将培养瓶平稳放入37°C, 5% CO₂的恒温培养箱中。

7. 初期“观察”：

   • 复苏后24小时内： 尽量不要移动或观察细胞，让它们安静贴壁。可在6-12小时后在显微镜下快速检查初步贴壁情况（非必需）。

   • 复苏后24-48小时： 进行首次全量换液，移除含有死细胞碎片和残留DMSO的旧培养基，加入新鲜的预热完全培养基。此后按常规培养进行。

第三部分：日常“照料” - Hep-3B培养与传代

• 换液： 通常每2-3天更换一次新鲜预热（37°C）的完全培养基。当培养基颜色变黄（指示代谢产物积累，pH下降）或细胞密度较高时，需要及时换液。

• 传代时机： 当细胞在培养瓶底部融合度达到80%-90%（显微镜下观察细胞间几乎没有空隙）时，就需要传代了。过度融合（100%）会抑制生长甚至导致细胞状态下降。

• 传代步骤：

  1. 准备： 预热PBS缓冲液、胰蛋白酶/EDTA消化液（如0.25%胰酶+0.02% EDTA）、完全培养基。准备好新的培养瓶并标记。

  2. 移除旧液： 吸出培养瓶中的旧培养基。

  3. 清洗： 加入适量无菌PBS（足以覆盖细胞层），轻轻晃动清洗细胞表面，去除残留血清（血清会抑制胰酶活性），吸弃PBS。

  4. 消化： 加入适量胰酶/EDTA消化液（覆盖细胞层即可，如T25瓶加1ml）。轻轻摇晃使消化液均匀覆盖细胞，放入培养箱37°C消化。

  5. 观察： 密切观察！ 通常需要1-3分钟。当显微镜下看到大部分细胞变圆、边缘折光性增强、并有少量细胞开始漂浮时（细胞间隙增大），立即停止消化。

  6. 终止： 加入2-5倍体积的预热完全培养基（血清可中和胰酶活性），用移液器轻柔、反复吹打培养瓶底面，将贴壁细胞完全吹打下来，形成单细胞悬液。吹打要彻底但轻柔。

  7. 离心（可选）： 如果需要精确计数或去除消化液，可将细胞悬液转移至离心管，200-300g离心5分钟，弃上清，用新鲜培养基重悬。如果细胞状态好且需要快速传代，有时也可直接将悬液按比例稀释分瓶。

  8. 分瓶接种： 将细胞悬液按需要的比例（通常1:3到1:6，根据细胞生长速度和实验需求调整）加入新的培养瓶中，再补充适量完全培养基至常规体积（如T25加5-6ml），轻轻混匀。

  9. 培养： 放入培养箱继续培养。

第四部分：“冬眠”保存 - Hep-3B冻存操作指南

冻存是为了长期保存珍贵的细胞资源。选择状态良好、处于对数生长期的细胞是关键。

1. 选择“最佳状态”：

   • 选择融合度在80%-90%、形态健康、无污染、处于对数生长期的细胞进行冻存。避免冻存状态不佳或过度融合的细胞。

2. 准备“冻存液”：

   • 提前配制冻存保护液：通常由完全培养基 + 10% DMSO组成，或者使用商品化的无血清冻存液（按说明书操作）。DMSO是关键冻存保护剂。必须现配现用或4°C短期保存（不超过几小时），使用前预冷（4°C或冰上）。

3. 收集细胞：

   • 按常规传代步骤进行消化、终止（使用完全培养基）、吹打成单细胞悬液。

   • 将细胞悬液转移至离心管，200-300g离心5分钟，彻底弃去上清。

4. 配制“生命悬液”：

   • 根据细胞沉淀的量，用预冷的冻存保护液重悬细胞。关键：细胞密度！ 推荐冻存密度为5×10⁶ 至 1×10⁷ 个细胞/ml。密度过低，复苏存活率差；密度过高，保护效果不佳且浪费资源。可用细胞计数板或自动计数仪精确计数。

   • 轻柔混匀： 避免剧烈震荡或产生气泡。

5. 分装“生命胶囊”：

   • 将细胞悬液快速、均匀地分装到预冷的、标记清晰的冻存管中（通常1.0 - 1.5 ml/管）。标记务必清晰、防水、耐低温： 包括细胞名称、代次、冻存日期、操作者。盖子务必拧紧。

6. “渐进式冬眠”：

   • 核心原则：慢冻！ 快速冷冻会形成致命的细胞内冰晶。

   • 推荐方法（程序降温盒）： 将冻存管放入含异丙醇的程序降温盒（如Nalgene® Mr. Frosty™），立即将盒子放入-80°C冰箱中过夜（通常需要4小时以上，异丙醇能提供约-1°C/分钟的降温速率）。

   • 替代方法（手工梯度降温）： 将冻存管依次置于：

     • 4°C冰箱，30分钟。

     • -20°C冰箱，1-2小时（或过夜，但不宜过长）。

     • -80°C冰箱，过夜。

   • 关键： 无论哪种方法，冻存管在放入-80°C之前，在4°C和-20°C的停留时间不宜过长（尤其-20°C），否则细胞易受损。

7. “终极沉睡”：

   • 经过-80°C过夜（或至少4小时以上）后，尽快将冻存管转移到液氮长期储存罐中。

   • 储存位置： 强烈推荐储存在液氮的气相中（液面以上，温度约-150°C至-190°C）。虽然液相温度更低（约-196°C），但存在冻存管密封不严导致液氮渗入、复苏时可能爆炸的风险。气相储存是更安全、更通用的做法。

第五部分：守护“生命线” - 关键注意事项总结（重中之重！）

1. 无菌是底线： 所有操作务必在生物安全柜或超净工作台中进行，严格遵循无菌操作规程。任何污染（细菌、真菌、支原体）都可能导致细胞死亡或实验数据无效。定期对培养箱、水浴锅、安全柜进行清洁消毒。

2. 温度是关键：

   • 培养基、PBS、胰酶等试剂使用前必须预热至37°C（水浴锅预热），避免冷热冲击。

   • 复苏时水浴锅必须精确37°C，解冻动作要快。

   • 培养箱温度（37°C）和CO₂浓度（5%）需定期校准，确保稳定。

3. DMSO：双刃剑：

   • 毒性： DMSO对细胞有毒性。复苏时必须快速稀释（步骤3）并彻底去除（离心步骤4）。接触细胞的时间越短越好。

   • 冻存保护： 冻存时DMSO浓度通常为10%，需用培养基配制。冻存液必须预冷，分装操作要快。

4. 时间即生命（复苏）： 从液氮取出到完全解冻、再到稀释，整个过程越快越好（最好控制在1-2分钟内），最大限度减少DMSO对解冻后细胞的损伤。

5. 冻存：状态、密度、慢冻：

   • 状态： 只冻存健康、对数期、无污染的细胞。

   • 密度： 5×10⁶ - 1×10⁷ 个细胞/ml 是最佳范围。

   • 慢冻： 必须使用程序降温盒或梯度降温法！ 禁止直接将冻存管丢入-80°C或液氮！

6. 储存安全：

   • 液氮气相储存： 首选。更安全（避免爆炸风险），温度足够低。

   • 防护： 取放液氮罐中的冻存管时，务必戴好防护面罩和厚手套。

   • 记录与备份： 详细记录冻存管位置信息（盒子编号、架子编号、行、列），建立电子和纸质档案。重要细胞株建议在不同液氮罐或不同地点进行备份。

7. 操作要轻柔： 无论是吹打细胞、离心还是移液，动作都要轻柔，避免机械损伤细胞。

8. 观察与记录： 复苏后、换液时、传代前，都要在显微镜下观察细胞形态、密度、有无污染。养成详细记录（操作日期、步骤、细胞状态、传代次数、培养基批号等）的习惯。

9. 定期检测： 对长期培养或复苏的细胞株，应定期进行支原体检测和细胞鉴定（如STR分型），确保细胞身份纯正、无污染。

10. 试剂质量： 使用高质量的胎牛血清、培养基、胰酶、DMSO等试剂。不同批次的血清可能影响细胞生长，必要时进行测试。

小结

Hep-3B人肝癌细胞是肝癌研究领域的宝贵资源。掌握其规范的复苏、培养和冻存技术，并时刻牢记那些关键的“生命细节”（无菌、温度、DMSO处理、时间控制、冻存原则、安全储存），是确保实验数据可靠、研究成果可重复以及珍贵细胞资源得以长期保存的根本保障。智立中特(武汉)生物科技有限公司愿与您携手，共同守护好这些“生命接力”的使者，为攻克肝癌贡献力量！