溶血性曼氏杆菌的精准识别与培养优化之道

在反刍动物（尤其是牛、羊）呼吸道疾病和乳腺炎的病原谱中，溶血性曼氏杆菌 是一个不可忽视的重要角色。这种革兰氏阴性杆菌以其强大的致病力和复杂的血清型，给全球畜牧业带来了显著的经济损失。智立中特（武汉）生物科技有限公司，作为深耕兽医诊断与生物制品领域的专业服务商，致力于为您提供精准的病原识别与高效的解决方案。本文将带您深入了解溶血性曼氏杆菌的特性、危害，并重点解析其关键的实验室培养技术。

一、 认识溶血性曼氏杆菌

1. 分类与命名：

   • 学名：Mannheimia haemolytica。曾归类于巴氏杆菌属（Pasteurella），后独立为曼氏杆菌属（Mannheimia）。

   • 因其在血琼脂平板上产生显著的β-溶血环（完全溶血）而得名“溶血性”。

2. 形态与特性：

   • 形态： 革兰氏阴性短杆菌或球杆菌，无芽孢，无鞭毛（通常不运动），有荚膜（是其重要的毒力因子）。

   • 培养特性： 需氧或兼性厌氧。对营养要求较高，初次分离常需富含血液或血清的培养基。

   • 溶血性： 在绵羊或牛血琼脂平板上培养18-24小时后，菌落周围产生清晰、宽阔的β-溶血环，这是其最显著、最重要的鉴定特征之一。

3. 血清型与致病性：

   • 存在多种血清型（基于荚膜抗原和菌体脂多糖抗原），其中 A1 和 A6 型 是牛呼吸道疾病综合征（BRD）中最常见且致病力最强的血清型，A2型在羊中更常见。

   • 主要宿主与疾病：

     • 牛： 运输热/牛呼吸道疾病综合征（BRD）的主要病原之一，常与其他病毒（如BVDV、IBRV、BRSV）或细菌（如多杀性巴氏杆菌、睡眠嗜组织菌）协同致病，导致纤维素性胸膜肺炎。也可引起乳腺炎、败血症、关节炎等。

     • 羊： 引起羔羊败血症/肺炎综合征（常与Bibersteinia trehalosi相关）的重要病原。

   • 毒力因子： 其致病力依赖于多种毒力因子：

     • 白细胞毒素（LKT）： 最关键的毒力因子！特异性裂解反刍动物的中性粒细胞和巨噬细胞，造成严重的组织损伤和炎症反应。

     • 荚膜： 抗吞噬作用。

     • 脂多糖（LPS）： 内毒素，引发炎症和休克。

     • 粘附素： 帮助细菌定植于呼吸道。

     • 蛋白酶等： 破坏宿主组织。

二、 为何重视溶血性曼氏杆菌的培养？

1. 精准诊断的基础： 从病料（如肺、鼻拭子、乳腺分泌物、关节液、血液）中分离培养出溶血性曼氏杆菌，是确诊其感染的金标准之一。结合菌落形态、溶血特征、染色镜检和生化鉴定（或分子检测），可明确病原。

2. 流行病学调查： 分离培养有助于了解特定地区或养殖场流行的血清型，为疫苗选择和防控策略制定提供依据。

3. 药物敏感性试验： 对分离纯培养物进行药敏试验，是指导临床合理用药、避免耐药性产生和减少治疗失败的关键。

4. 疫苗与诊断试剂研发： 培养获得大量纯净的菌体是制备灭活苗、亚单位苗、诊断抗原或抗体的前提。

5. 基础研究： 深入研究其生物学特性、致病机制、耐药机制等，都离不开可靠的培养技术。

三、 溶血性曼氏杆菌的实验室培养要点（智立中特专业视角）

成功分离和培养溶血性曼氏杆菌需要注意以下关键环节：

1. 样本采集与运输：

   • 无菌操作采集新鲜病料（如肺病变组织、支气管肺泡灌洗液、鼻拭子、乳样、血液等）。

   • 尽快送检。若需运输，使用适宜的转运培养基（如含活性炭的Stuart或Amies培养基），冷藏（4°C）并避免冻结（冰晶会损伤细菌）。

   • 智立中特提醒：样本质量是成功分离的第一步！

2. 培养基选择：

   • 基础培养基： 常用营养丰富的培养基作为基础。

     • 胰酶大豆琼脂（TSA）： 最常用基础。

     • 脑心浸液琼脂（BHI）： 营养更丰富，有利于生长。

     • 哥伦比亚血琼脂： 本身营养较好。

   • 增菌添加剂：

     • 血液： 必不可少！ 推荐添加 5-10% 脱纤维绵羊血 或 牛血。这是观察β-溶血现象的关键，且提供必要的生长因子。马血或兔血也可用，但溶血环可能不如绵羊/牛血明显。

     • 血清： 有时添加胎牛血清（FBS）或马血清（5-10%）可促进某些菌株生长。

     • NAD（辅酶I/ V因子）： 某些菌株可能需要（但通常不如副猪嗜血杆菌依赖性强）。若基础培养基不含，可考虑添加。

   • 选择性培养基： 当样本中杂菌较多时（如鼻拭子），可选用含抗生素（如林肯霉素、壮观霉素、多粘菌素B、杆菌肽等）的选择性培养基（如改良的Pasteurella选择性琼脂），抑制杂菌生长，提高目标菌分离率。智立中特可提供或定制优化配方的选择性培养基。

3. 培养条件：

   • 温度： 37°C 是最适生长温度。

   • 气体环境： 需氧环境即可满足大部分菌株生长。通常在普通大气环境（含约5% CO2的环境亦可）下培养。无需严格厌氧或高浓度CO2。

   • 时间： 培养 18-24小时 后通常可见明显菌落。某些菌株或样本中细菌量少时，可能需要培养至48小时。

4. 菌落观察与初步鉴定：

   • 菌落形态： 在血琼脂平板上，18-24小时后形成直径约1-3mm、灰白色、半透明、光滑湿润、边缘整齐的菌落。

   • 核心特征 - β-溶血： 菌落周围出现清晰、界限分明、宽度不一的完全溶血环（β-溶血）。这是识别溶血性曼氏杆菌的首要且最重要的特征！

   • 卫星生长现象： 在靠近金黄色葡萄球菌划线处，溶血性曼氏杆菌可能生长更旺盛（因葡萄球菌分泌的NAD扩散），但此现象不如流感嗜血杆菌典型，且非必须鉴定步骤。

5. 纯化与确证：

   • 挑取具有典型溶血环的单个菌落，划线接种到新的血琼脂平板进行纯化。

   • 纯化后进行：

     • 革兰氏染色镜检： 确认为革兰氏阴性小杆菌。

     • 生化鉴定： 通常使用商品化的生化鉴定系统（如API 20 NE, VITEK GN卡等）或进行关键生化试验（如氧化酶阳性、发酵葡萄糖产酸不产气、吲哚阴性、脲酶阴性等）与其他相似菌（如多杀性巴氏杆菌、睡眠嗜组织菌等）区分。

     • 分子生物学鉴定（可选但推荐）： 针对特定基因（如rpoB, 16S rRNA）或血清型特异性基因（如lktA）进行PCR检测，提供最准确快速的鉴定结果。智立中特提供高灵敏度和特异性的病原核酸检测服务及试剂盒。

四、 培养中的挑战与智立中特解决方案

• 挑战1：杂菌污染。

  • 方案： 使用合适的选择性培养基；确保无菌采样和操作；样本及时处理。

• 挑战2：营养要求高/生长缓慢。

  • 方案： 使用高质量的脱纤维绵羊/牛血；必要时添加血清；保证培养基新鲜；培养时间充足（48小时）。

• 挑战3：溶血现象不明显。

  • 方案： 确认使用的是绵羊血或牛血（避免兔血、马血可能的不理想效果）；血液浓度足够（5-10%）；培养基质量良好；排除非溶血性曼氏杆菌或其他细菌（需结合其他鉴定方法）。智立中特提供高品质的动物血清和优化配方的血平板。

• 挑战4：菌株变异或血清型多样。

  • 方案： 结合生化鉴定和分子分型（如PCR血清分型） 进行精确鉴定。智立中特拥有成熟的分子诊断平台。

结语

溶血性曼氏杆菌是严重威胁反刍动物健康的重要病原。深入了解其生物学特性和致病机制，掌握精准可靠的实验室分离培养技术，是有效防控其引发的疾病、减少经济损失的基础。从样本的科学采集到培养基的优化选择，再到培养条件的精确控制以及后续的精准鉴定，每一个环节都至关重要。

智立中特（武汉）生物科技有限公司，依托专业的团队和先进的平台，为您提供：

• 高品质培养基与试剂： 优化的TSA基础、脱纤维绵羊/牛血、选择性琼脂等。

• 精准的病原分离与鉴定服务： 包括细菌培养、生化鉴定、分子检测（PCR、测序）及血清分型。

• 药敏试验服务： 指导临床科学用药。

• 定制化解决方案： 根据您的特定需求，提供从样本处理到结果分析的一站式服务。

让我们携手，共同提升对溶血性曼氏杆菌等动物病原的认知和防控能力，为畜牧业的健康发展保驾护航！