铜绿假单胞菌PAO1：复苏、培养、操作指南与应用全景

一、菌株简介：模式生物的价值

铜绿假单胞菌PAO1（Pseudomonas aeruginosa PAO1）是该种的标准参考菌株，分离自伤口感染。作为革兰氏阴性需氧杆菌，其基因组于2000年率先完成测序，为微生物遗传学、致病机理、生物膜形成、抗生素耐药性及代谢工程研究提供了无可替代的平台。

二、核心操作流程与关键技术要点

1. 复苏（Reviving from Frozen Stock）

   • 准备： 预热水浴至37℃；开启超净台，紫外灭菌30分钟；准备无菌LB或TSB液体培养基（5-10mL）及平板。

   • 解冻： 从-80℃冰箱快速取出冻存管（通常为含30%甘油的菌悬液），立即置于37℃水浴，轻柔晃动至内部冰晶刚融化（约1-2分钟），切勿长时间水浴。

   • 转移与清洗（可选但推荐）： 取100μL菌液加入预温的无菌培养基中。为去除甘油，可离心（如4000 rpm, 10 min）后弃上清，用新鲜培养基重悬菌体。

   • 培养活化： 30-37℃摇床（200-250 rpm）培养6-18小时，或涂布平板于37℃培养16-24小时。

   • 关键点： 操作全程在超净台进行；避免反复冻融；解冻后尽快移出菌体。

2. 培养（Culturing）

   • 培养基：

     • 通用型： LB肉汤/LB琼脂、TSB（胰蛋白胨大豆肉汤）最常用。

     • 特定需求： 遗传操作（低盐LB）、生物膜研究（改良M63或流式腔室）、特定代谢研究（限定成分培养基）。

   • 条件：

     • 温度： 37℃（最适生长与致病相关研究）或30℃（常规培养、高密度生长）。

     • 氧气： 严格需氧。液体培养需充分振荡（200-250 rpm），琼脂平板需正常有氧环境。

     • 时间： 液体培养通常6-18小时（依接种量及需求定）；平板培养16-24小时可见菌落。

   • 菌落形态： 中等大小，湿润光滑，扁平或微凸，边缘整齐，产生绿色素（绿脓菌素pyocyanin）和/或黄绿色素（荧光素pyoverdine），有特征性葡萄汁或玉米片气味。

3. 规范操作（Aseptic Technique）

   • 核心： 无菌操作是生命线！全程在酒精灯火焰旁或超净台内进行。

   • 环境： 超净台使用前需紫外灭菌并用酒精擦拭台面；定期监测洁净度。

   • 器材： 移液器吸头、培养皿、离心管、接种环/针等均需灭菌。

   • 操作： 开盖前灼烧瓶口/管口；移液动作迅速准确；避免手部越过敞口容器上方；及时清理台面。

   • 生物安全： PAO1为BSL-1，但经基因改造后可能升级。实验人员需穿实验服、戴手套，操作后彻底洗手消毒。废弃物需灭菌处理。

4. 培养问题排查（Troubleshooting Poor Growth）

   • 现象： 生长缓慢、菌液浑浊度低、菌落细小稀少。

   • 排查：

     • 复苏问题： 冻存菌株活力丧失？解冻不当？

     • 培养基： 过期？配制错误？pH偏离（宜中性）？未高压灭菌彻底？

     • 培养条件： 温度不准？摇床转速不足？氧气供应不足？

     • 污染： 存在杂菌抑制生长？（见下文污染预防）

     • 菌株特性： 是否携带影响生长的突变？进行过基因操作？

   • 对策： 复苏新批次冻存菌；更换新鲜配制灭菌的培养基；校准设备；严格无菌操作；必要时重新划线纯化或重新构建菌株。

5. 污染预防（Contamination Prevention）

   • 环境监控： 定期对超净台、培养箱、冰箱进行沉降菌和擦拭取样检测。

   • 无菌检测： 培养基、缓冲液灭菌后留样培养，确认无菌后方可使用。

   • 分区操作： 洁净物品与污染物品分区存放；不同实验区域（如PCR区、细菌操作区）物理分隔。

   • 专用试剂： 抗生素、选择剂等分装小份，避免反复取用污染。

   • 定期纯化： 长期传代或实验关键节点前，进行平板划线纯化，挑取单菌落。

   • 个人卫生： 严格穿戴防护，操作中减少走动和交谈。

三、菌株管理：保藏与冻存

1. 短期保藏（Short-Term Storage）

   • 斜面/平板： 新鲜活化菌株接种于含培养基的斜面或平板，培养好后用Parafilm密封，4℃保存。一般可存活1-2个月。

   • 穿刺培养： 半固体琼脂穿刺培养，密封后4℃保存。保存期类似斜面。

2. 长期冻存（Long-Term Cryopreservation）

   • 甘油保存（最常用）：

     • 取对数生长期菌液（OD600≈0.5-1.0），加入等体积灭菌的60%甘油溶液（终浓度30%），或直接加入灭菌甘油（终浓度15-20%）。

     • 轻柔混匀，分装至无菌冻存管。

     • -80℃冰箱保存（可稳定数年）。

   • 冷冻干燥（Lyophilization）： 将菌悬液与保护剂（如脱脂奶、蔗糖）混合，冷冻干燥后密封保存于4℃或-20℃。保存期极长（10年以上），但对设备和技术要求高。

四、身份确认：鉴定方法

1. 形态学观察： 革兰氏染色（阴性杆菌）、菌落形态（色素、气味）。

2. 生化试验： 氧化酶阳性、葡萄糖氧化发酵（OF）试验为氧化型、精氨酸双水解酶阳性、42℃生长等。

3. 分子生物学鉴定（最可靠）：

   • 种属鉴定： 16S rRNA基因测序。

   • 菌株特异性鉴定（确认是PAO1）： PCR扩增检测PAO1特有的基因标记（如通过引物扩增其特有的oprL基因片段或利用全基因组测序比对）。

五、广泛的应用领域

1. 基础科学研究：

   • 致病机制模型： 研究毒力因子（如III型分泌系统、外毒素A、弹性蛋白酶）、生物膜形成调控、群体感应（Quorum Sensing）机制。

   • 抗生素耐药性研究： 探索固有耐药性（外膜低通透性、外排泵）及获得性耐药机制（如β-内酰胺酶、突变）的重要模型。

   • 代谢网络与调控： 研究其强大的中心代谢（如TCA循环）及多样化的营养利用能力。

   • 环境适应性研究： 研究其在各种逆境（如氧化应激、渗透压胁迫）下的生存策略。

2. 生物技术与工业应用：

   • 工业酶生产： 生产蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等。

   • 生物修复（Bioremediation）： 降解环境污染物（如芳香烃化合物、氰化物、有机溶剂）。

   • 生物防治（Biological Control）： 某些菌株（非PAO1）用于防治植物病原真菌。

   • 生物表面活性剂： 生产鼠李糖脂等。

   • 生物燃料与化学品： 作为代谢工程宿主生产潜在生物燃料前体或高附加值化学品。

3. 材料科学：

   • 生物膜研究： 作为生物膜研究的金标准模型，用于开发抗生物膜材料（如医疗器械涂层）。

   • 生物材料合成： 利用其合成聚羟基脂肪酸酯（PHA）等生物可降解塑料。

4. 教学与标准：

   • 微生物学、遗传学、分子生物学实验教学的常用菌株。

   • 作为质量控制、方法验证、抗生素药敏试验的参考菌株。

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