多杀性巴氏杆菌：从精准培养到创新应用的生物技术突破

一、多杀性巴氏杆菌概述

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）是一种革兰氏阴性、非运动性、兼性厌氧的短杆菌，广泛存在于哺乳动物和禽类的上呼吸道及消化道中。该菌根据荚膜抗原（A、B、D、E、F型）和脂多糖抗原（16种血清型）可分为多个亚型，不同亚型的宿主特异性和致病性差异显著。作为重要的人畜共患病病原体，其感染可引发禽霍乱、牛出血性败血症、猪萎缩性鼻炎等疾病，对人类则可能导致伤口感染或呼吸道炎症。

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二、多杀性巴氏杆菌的培养技术

1. 培养基选择
   推荐使用营养丰富的培养基，如：

   • 血液琼脂培养基：添加5%-10%脱纤维羊血，支持其快速生长并观察溶血现象。

   • 脑心浸液（BHI）肉汤：适用于液体培养，便于获取高浓度菌体。

   • 选择性培养基（如含新生霉素的改良马丁琼脂）：抑制杂菌生长，提高分离效率。

2. 培养条件优化

   • 温度：最适生长温度为37℃，部分禽源菌株在42℃下亦可增殖。

   • 气体环境：需5%-10% CO₂环境，尤其在初代分离时能显著促进荚膜形成。

   • pH值：中性偏碱（pH 7.2-7.4）最适宜，酸性环境会抑制代谢活性。

3. 培养步骤

   • 样本接种后，37℃培养18-24小时，菌落呈灰白色、半透明、光滑湿润，直径约1-2mm。

   • 液体培养时，每4小时监测OD600值，对数生长期通常持续6-12小时。

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三、培养过程中的关键注意事项

1. 严格无菌操作

   • 超净工作台需提前紫外灭菌30分钟，接种环需火焰灼烧至红热冷却后使用。

   • 液体转种时使用防溅移液枪，避免气溶胶污染。

2. 代谢副产物调控
   该菌代谢产生乙酸等有机酸，当培养液pH降至6.5以下时应及时更换培养基或加入缓冲剂（如HEPES）。

3. 菌株保存

   • 短期保存：穿刺接种半固体培养基，4℃可存活2-3周。

   • 长期保存：与20%甘油混合后-80℃冻存，或采用冷冻干燥技术。

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四、污染防控体系

1. 交叉污染阻断

   • 分区操作：样本预处理、接种、鉴定分别在独立生物安全柜中进行。

   • 环境监测：每周进行沉降菌检测，菌落数需≤1 CFU/皿（φ90mm）。

2. 抗生素干预策略
   针对常见污染菌：

   • 真菌污染：添加两性霉素B（2.5 μg/mL）

   • 革兰氏阳性菌：万古霉素（10 μg/mL）

   • 革兰氏阴性菌：多粘菌素B（50 IU/mL）

3. 分子检测保障
   每批次培养物需进行16S rRNA基因测序验证，引物设计参考Pm-PCR体系（如KMT1基因特异性引物）。

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五、多杀性巴氏杆菌的核心价值与应用

1. 疫苗研发

   • 灭活疫苗：C48-1株（禽霍乱疫苗）保护率达90%以上。

   • 亚单位疫苗：基于OmpA蛋白的重组疫苗已进入临床试验。

2. 诊断试剂开发

   • 胶体金试纸条：检测荚膜多糖抗原，15分钟快速诊断。

   • ELISA试剂盒：定量检测血清抗体效价，灵敏度达1:3200。

3. 生物医学研究

   • 毒力因子研究：ToxA基因调控猪萎缩性鼻炎发病机制。

   • 宿主互作模型：建立小鼠鼻腔感染模型研究免疫应答。

4. 工业酶制剂
   该菌分泌的神经氨酸酶可用于血型转换试剂生产，酶活可达1500 U/mg。

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六、未来应用前景

随着CRISPR基因编辑技术的应用，基因缺失株（如ΔhyaE突变体）的构建显著提升了疫苗安全性。合成生物学技术推动的代谢工程改造菌株，在生物合成领域展现出生产高附加值化合物（如透明质酸）的潜力。

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