pET28a-EGFP 重组大肠杆菌培养及质粒提取指南

一、实验材料

1. 菌株：含 pET28a-EGFP 质粒的大肠杆菌（如 BL21(DE3)）

2. 培养基：

   • LB 液体培养基（含 50 μg/mL 卡那霉素）

   • LB 固体培养基（含 50 μg/mL 卡那霉素，1.5% 琼脂）

3. 试剂：

   • 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，诱导 EGFP 表达）

   • 质粒提取试剂盒（如 TIANGEN 或 QIAGEN 离心柱型试剂盒）

   • 无菌甘油（保存菌种）

4. 设备：恒温摇床、离心机、超净工作台、荧光显微镜/蓝光激发仪、核酸电泳系统。

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二、培养步骤

1. 菌种活化

• 步骤：

  • 从 -80℃ 甘油保存的菌种中挑取单菌落，划线接种于含卡那霉素的 LB 固体培养基，37℃ 倒置培养 12-16 小时。

  • 挑取单菌落接种至 3-5 mL 含卡那霉素的 LB 液体培养基，37℃、200 rpm 振荡培养 12 小时（过夜）。

2. 扩大培养

• 步骤：

  • 按 1:100 比例将过夜菌液转接至新鲜 LB 液体培养基（含卡那霉素），37℃、200 rpm 振荡培养至 OD600 ≈ 0.6（约 2-3 小时）。

  • 诱导表达：加入终浓度 0.5-1 mM 的 IPTG，30℃、180 rpm 诱导培养 4-6 小时（EGFP 在低温下更易正确折叠，荧光更强）。

  • 荧光验证：取 1 mL 菌液离心弃上清，用 PBS 重悬，蓝光激发下观察绿色荧光（验证表达成功）。

3. 菌种保存

• 步骤：将诱导后的菌液与无菌甘油按 1:1 体积混合，-80℃ 长期保存。

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三、质粒提取（试剂盒法）

1. 菌体收集

• 取 1-5 mL 菌液（OD600 ≤ 4），12,000 rpm 离心 1 分钟，弃上清，收集菌体。

2. 裂解与纯化

• 按试剂盒说明书操作（以 TIANGEN 质粒小提试剂盒为例）：

  • 加入 250 μL Buffer P1（含 RNase A）重悬菌体，涡旋混匀。

  • 加入 250 μL Buffer P2，轻柔颠倒混匀 4-6 次至溶液变清亮（裂解时间 ≤ 5 分钟）。

  • 加入 350 μL Buffer P3，立即轻柔颠倒混匀至白色絮状沉淀，12,000 rpm 离心 10 分钟。

  • 将上清转移至吸附柱，离心弃废液，用 Buffer PW 洗涤 2 次。

  • 空柱离心 2 分钟去除残留乙醇，将吸附柱置于新 EP 管中，加 50-100 μL Elution Buffer 洗脱质粒。

3. 质粒检测

• 浓度与纯度：NanoDrop 测定 A260/A280（理想值 1.8-2.0）。

• 完整性：1% 琼脂糖凝胶电泳（pET28a 载体约 5.3 kb，EGFP 插入约 0.7 kb，质粒应呈超螺旋主带）。

• 测序验证：送测序公司确认 EGFP 基因无突变。

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四、注意事项

1. 抗性选择：全程使用含卡那霉素的培养基，避免质粒丢失。

2. 诱导条件优化：若荧光较弱，可调整 IPTG 浓度（0.1-1 mM）、诱导温度（16-30℃）或时间（4-16 小时）。

3. 质粒纯度：避免过度裂解（Buffer P2 作用时间过长会导致基因组 DNA 污染）。

4. 荧光观察：EGFP 需蓝光激发（~488 nm），避免长时间光照导致淬灭。

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五、应用示例

• 蛋白表达：诱导后的菌体可进一步破碎纯化 EGFP 蛋白。

• 质粒用途：转化其他宿主菌、基因编辑或作为荧光报告载体。