细胞传代的介绍与一般细胞传代流程注意事项

　　为什么传代后细胞存活率不佳？

　　为什么细胞生长不均匀？

　　为什么细胞生长越来越慢？

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　　细胞传代作为细胞培养中的重要步骤

　　1.什么是细胞传代

　　细胞在培养过程中不断增殖，培养皿/瓶空间有限，当细胞接触过密，生长就会受到抑制，影响细胞状态，因此要把其中一部分细胞分到别的培养皿/瓶，使细胞能够持续扩增。

　　细胞传代可以帮助我们扩大细胞培养的数量，同时也避免了因细胞进入平台期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。

　　2.一般细胞传代流程&注意事项

　　No.1材料准备

　　仪器

　　①离心机②水浴锅③酒精灯④超净工作台

　　溶液配制

　　①PBS液②0.25％胰蛋白酶③基础培养基④胎牛血清

　　No.2传代前准备

　　（1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液的瓶子放入37℃温箱/洁净水浴锅内预热，用酒精棉球擦拭好后放入超净台内；

　　（2）75％酒精擦拭超净工作台消毒、紫外线照射30min；

　　（3）在超净工作台中按次序摆放好无菌的移液器、移液管、离心管、巴斯德管、培养瓶等；

　　（4）75%的酒精擦拭双手消毒；

　　（5）点燃酒精灯：注意火焰不能太小，注意酒精量不能超过瓶身的2/3。

　　No.3实验步骤

　　（1）从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞；

　　（2）在超净工作台内将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒，保证细胞瓶的开口朝向酒精灯方向并保持10cm距离防止明火扰乱气流杂质落入培养体系；

　　（3）小心吸出旧培养液，加3ml无菌PBS后盖上瓶盖，轻轻摇动细胞瓶冲洗细胞，倒弃；

　　（4）根据培养瓶的大小加入适量的胰蛋白酶，根据不同细胞选择不同消化条件，一般最佳消化温度是37℃，但是易消化的细胞要注意消化时间避免过度消化；

　　（5）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度（注：若细胞叠层生长可先用少量胰酶将叠层细胞消化下来，再对底层生长均匀的细胞进行正常的消化操作，正常细胞避免二次消化）；

　　（6）加入2倍体积的完全培养基（含血清）中止胰蛋白酶的作用，用巴斯德管/移液管/吸头等将已经消化细胞吹打成细胞悬液；

　　（7）将细胞悬液吸入15 ml离心管中；

　　（8）平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000rpm/min离心5分钟；

　　（9）弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2 ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液；

　　（10）分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。

　　（11）用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱（推荐使用瑞沃德D180-P二氧化碳培养箱）中继续培养。1.5~2小时左右开始沉降并贴附在瓶壁上。

　　No.4注意事项

　　（1）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染；

　　（2）倒置显微镜下观察细胞量，必要时进行细胞计数。密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml；

　　（3）在每一个培养瓶做好标记，至少包括细胞名称、细胞代数、接种日期、接种人；

　　（4）部分传代细胞（如PC12细胞),少量的胰蛋白酶不影响细胞的生长，故可跳过实验步骤(7)-(9);

　　（5）严格的无菌操作；

　　（6）适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

　　3.常见操作问题&解答

　　Q:贴壁细胞传代如何使用胰酶？

　　A：一般使用trypsin-EDTA浓度为0.25%trypsin-0.53mMEDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液浓度过高时，易造成培养基中细胞碎片增多，黑渣增多，常规细胞传代时建议用0.05%的胰酶进行消化，对于难消化的细胞可采用0.25%胰酶进行消化，细胞密度过高超过80%时，采用分步消化法。胰酶储存在–20°C，解冻在4°C进行，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20°C，避免反复冷冻解冻造成trypsin活性降低，并可减少污染机会。

　　Q:如何控制胰酶消化时间？

　　A：胰酶消化的程度是细胞培养中的一个关键步骤：消化过度，严重影响细胞活性，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。

　　不同细胞对消化液的敏感性不同，胰酶消化的时间也会有差异。胰酶消化时间与胰酶的浓度，是否含EDTA，胰酶的储存时间，胰酶的储存温度，是否反复冻融，消化加入的胰酶体积，消化温度及细胞的密度等有关。对于新购买的细胞，建议客户先用低浓度的胰酶仔细去摸索一下消化时间，可每隔1分钟镜下观察细胞是否变圆，记录最佳消化时间，下一次操作参考之前的记录来控制时间即可。

　　Q:贴壁细胞如何进行传代？

　　A：去掉原培养瓶里面的培养基，加3-4ml PBS洗1-2次；弃PBS，再加1.5ml的Trypsin-EDTA(1X)消化液消化细胞，显微镜下观察，待细胞变圆，细胞间隙明显，部分细胞刚开始脱离瓶壁，加4ml左右完全培养液混匀终止消化，将细胞小心吹打下来，1000 rpm/min室温离心5min；弃上清，细胞沉淀用完全培养液重悬，按要求分瓶（视细胞密度而定1:2-1:3，1:3-1:6，1:6-1:8），每瓶补足培养基至5-6ml，37℃、5%CO2孵箱培养。