小鼠胚胎干细胞基因敲除与筛选全攻略

　　基因敲除技术主要用于建立动物模型，其中小鼠是最成熟的实验动物。通过小鼠进行DNA重组研究，可以“敲除”特定基因。以下是基因敲除的主要步骤：

　　1️⃣分离胚胎干细胞：从早期胚胎或原始性腺中分离胚胎干细胞（ES或EK细胞），这些细胞中含有需要改造的基因，称为“靶基因”。

　　2️⃣构建基因载体：将目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子重组到带有标记基因（如neoR基因，新霉素抗性基因）的载体上，形成重组载体。这样会使靶基因失活，即无法表达。

　　3️⃣显微注射：将含有neoR基因的靶基因通过显微注射法转移入胚胎干细胞，再通过同源互换，用失活靶基因取代两个正常靶基因中的一个，完成对胚胎干细胞的基因改造。

　　4️⃣筛选培养：将处理后的胚胎干细胞转移到含有新霉素的培养基中进行筛选培养。

　　5️⃣嵌合体小鼠：科学家可以通过基因敲除技术治疗疾病。但获得的基因敲除小鼠体内仍有一个正确的靶基因，因此需要进一步处理。将筛选出来的靶细胞导入鼠的囊胚中，再将此囊胚植入假孕母鼠体内（同期发情且未经配种的母鼠），使其发育成嵌合体小鼠。

　　6️⃣获得纯合体：由于同源重组常发生在一对染色体中的一条染色体上，因此需要至少两代遗传才能获得稳定遗传的纯合体基因敲除模型。

　　（1️⃣）F0代阳性小鼠与野生型小鼠交配，获得PCR和测序鉴定阳性的F1代杂合子鼠（－表示基因已经敲除）。

　　（2️⃣）选择来自同一只F0代小鼠、基因型一致的F1代小鼠，达到性成熟后进行互配，可获得F2代小鼠。对F2代小鼠进行PCR及测序鉴定，理论上，F2代小鼠中25%为纯合子，50%为杂合子，25%为野生小鼠。

　　（3️⃣）对获得的F2代鼠进行PCR及测序鉴定，得到纯合子小鼠。

　　通过以上步骤，科学家可以成功建立基因敲除小鼠模型，进一步研究基因功能和治疗相关疾病。