常见细胞污染不同情况的解决方法汇总

　　细胞污染是细胞培养实验室中最常见的问题，有时也会造成比较严重的后果。细胞培养污染物一般可分为两大类：一类是化学污染物，如培养基、血清和水中的杂质，包括内毒素、增塑剂和洗涤剂；另一类是生物污染物，如细菌、霉菌、酵母、病毒和支原体，以及其他细胞系的交叉污染；虽然污染无法完全消除，但可以通过全面了解其来源并遵循良好的无菌技术，从而降低污染的发生频率和严重性。

　　细胞污染一般可分为微生物污染和真核生物污染。其中微生物污染包括真菌和酵母、细菌、支原体等。而真核生物一般是细胞系间的交叉污染。细胞常见的污染情况总结如下：

　　1、细菌污染：

　　细菌是一种原核细胞微生物，其大小以微米(μm)计。常见的污染细菌有革兰氏阴性菌和大肠杆菌、假单胞菌等，革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比较常见。

　　一旦发生细菌污染较易发现，多数情况下培养液短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显混浊现象；有时静置的培养液液体初看不混浊，但稍加振荡，就有很多混浊物漂起。倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类；有的培养液改变不明显而又疑有污染，可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可取10ml细胞悬液以100rpm离心5min，沉淀中加入无抗生素的培养液2ml，置于37℃培养，24h可得结果。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。

　　看到这种，别犹豫了你的细胞被污染了，那么怎么办呢，基本原则立马扔掉，别扩大污染，如果你的细胞真的十分宝贵，先用带有双抗的PBS反复冲洗几遍，然后再培养液中加入硫酸庆大霉su、新霉su（50ug/ml）等，培养3天后换成带有双抗的培养液培养。

　　2、真菌污染：

　　是细胞培养过程中常见的一种，尤其在梅雨季节进行细胞培养易污染。污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊，倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝状、管状、及树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培养液中。很多菌丝在高倍镜可见到有链状排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。

　　真菌污染真的不建议处理，因为孢子容易飘散，可能这瓶没9过来，又扩大了污染，建议预防为主，在培养箱的水中加入硫酸铜，就是蓝色的那种东西。哎，如果你非救不可，可以采用两性霉su B（0.25-2.5），三天后换液加入含PS的培养液。

　　3、支原体污染：

　　支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(小直径0．2um)并生活的微生物。约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性。可为圆形、丝状或梨形。

　　支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构。其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群或中央束。

　　支原体污染细胞后，培养液可不发生混浊。多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解，因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落。

　　如果怀疑细胞被支原体污染可使用支原体检测试剂盒进行检测，如果确定是支原体污染可以选择支原体去除试剂进行处理。

　　4、霉菌污染

　　同真菌感染一致，因为培养液是清亮的，所以霉菌污染早期难以发现，等发现时往往已经为时过晚了。培养液中慢慢地出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，如同风中柳絮，一般不仔细看发觉不出来。细胞仍可生长，但时间一长，细胞的状态就变差，不再增长。

　　处理方法：建议果断舍弃该污染细胞，将环境彻底消毒，因为霉菌的顽固可能会导致下几批细胞都会污染，所以，采用酒精彻底底地擦洗一遍CO2孵箱。然后再用新洁尔灭擦洗一遍，把水盘里加上饱和量的硫酸铜。千万不可大意!

　　5、黑胶虫污染

　　开始污染时对细胞无影响，当数量达到一定程度时就会对细胞产生影响。400倍显微镜下可见点状或片状游动小体，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除换血清外无须特殊处理。

　　处理方法：可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率，尽早处理细胞，越快越好。如果实在来不及了。

　　注意事项：

　　1、要保证实验室和培养箱的洁净，按时杀菌，可以用酒精擦拭和紫外照射的方法。必要时可以通臭氧过夜。

　　2、新到的细胞、培养基、血清都可以做一下简单的污染检测后再开始实验。另外要注意每次试剂量配制不宜过多，建议分装使用，分装时用针头滤器过滤一次。

　　3、进行实验操作时一定要按照实验室的要求，确保无菌操作。准备好细胞房专业连体洁净衣，戴好口罩和手套。所有进超净台的物品最好都用酒精擦拭一遍，超净台里面的东西一定要尽量少放，东西太多会影响超净台内空气流通及空气除菌。

　　急救方法：

　　1、判断污染源：一旦发现细胞有污染的迹象或已污染，立即判断可能的污染源：有无操作不当？培养基、胰酶、PBS等颜色、澄清度是否正常？

　　2、及时处理：若确定现有的培养基、胰酶、PBS可用，则继续使用；若无法确定则新配完全培养基、PBS、胰酶，原有的液体在确定是否污染后再做处理。

　　注：若条件允许，细胞污染后zui好的处理方式是：丢弃！！！

　　1、若为霉菌污染，在以PBS润洗2~3遍后换液，无需加入高浓度双抗。培养48h后污染未再次出现即可。

　　2、若为真菌污染，在PBS润洗、换液后可加入两性霉素B（两性霉素B有细胞毒性，不推荐使用），也可加入300μg/mL氟康唑培养，污染控制后改用150μg/mL培养2~3代

　　3、若怀疑支原体污染，则可进行PCR检测或直接使用支原体清除试剂。也可购买环丙沙星注射液，于超净台内打开直接添加到培养基中，以20μg/mL浓度2代后改用10μg/mL浓度持续培养约2周。

　　很多人把自己培养的细胞称为宝宝不是没有道理的，因为细胞确实就是这么的脆弱，但是只要我们做好预防，用心仔细，大多数细胞污染是完全可以避免的。