微生物菌种冻干保藏法具体操作说明

　　微生物广泛分布于自然界中的一群肉眼看不到的微小生物，包括细菌、螺旋体、立克次体、衣原体、支原体、放线菌、真菌、病毒等类，其结构简单，以单细胞、细胞群体或非细胞状态存在，在提供营养物质和适宜环境的条件下，一般都能独立生活，迅速生长繁殖。微生物菌种可培养的具有保藏价值的微生物纯培养（株）。

　　微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。

　　微生物菌种用各种适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有形状基本稳定，以便于研究、交换和使用的目的。微生物菌种常规保藏法分为定期移植保藏法、液体石蜡保藏法、沙土管保藏法、低温冷冻保藏法和冷冻干燥保藏法5种。

　　下面来详细了解微生物菌种冻干保藏方法：

　　菌种冻干保藏方法亦称冻干法,是在无菌条件下将欲保藏的菌种制成悬浮液后冻结,在真空条件下使冰升华直至干燥,从而使微生物的生理活动趋于停止面长期维持存活状态的一种菌种保藏方法。冻干机适用于大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次体、霉菌和酵母等的真空冷冻干燥保藏，但不适于霉菌的菌丝型、菇类、藻类和原虫等。生物菌种冻干保存步骤，其操作流程如下：

　　1、安瓿管准备

　　安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。

　　2、保护剂的选择和准备

　　保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100℃间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。

　　3、冻干样品的准备

　　在适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后(参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》(试行))，与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜(以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支)。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。

　　4、预冻

　　一般预冻2小时以上，温度达到-20℃到-35℃左右。

　　5、冷冻干燥

　　采用冻干机进行冷冻干燥。将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。

　　终止干燥时间应根据下列情况判断：

　　安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状；

　　真空度接近空载时的最-高值；

　　样品温度与管外温度接近；

　　选用1-2支对照管，其水份与菌悬液同量，视为干燥完结；

　　选用一个安瓿管，装1-2%氯-化钴，如变深兰色，可视为干燥完结；

　　冷冻干燥完毕后，取出样品安瓿管置于干燥器内，备用。

　　6、真空封口及真空检验

　　将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。

　　7、保藏

　　安瓿管应低温避光保藏。

　　8、质量检查

　　冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。