假期快到了！细胞该怎么冻存？

　　一般来说，细胞进行转移和保存，最佳的策略是进行低温保存（-70℃~-196℃），而细胞深低温保存的基本原理是：在-70℃以下时，细胞内的酶活性均已停止，即代谢处于完全停止状态，故而可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程，在此温度范围内，冰晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。

　　经过前人的长期试验，发现细胞的冻存及复苏基本原则是慢冻速融，这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

　　复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

　　No.1、材料准备

　　1.仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。

　　2.玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、培养瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、废液缸。

　　3.塑料器皿：吸头、枪头、胶塞、移液管（10ml）、15ml离心管、冻存管（1～2ml）。

　　4.其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。

　　5.试剂：D-Hanks液、胎牛血清、培养液、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油。

　　No.2、细胞冻存

　　1、10%的DMSO+90%胎牛血清。甘油一般用于菌种保存很少用于细胞冻存。

　　2、取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中。

　　3、离心1000 rpm,5 min。

　　4、去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5x10^6/ml~1x10^7/ml。

　　5、在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。

　　6、冻存：标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/min；当温度达到-25℃以下时，可增至-5℃~-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

　　No.3、细胞复苏

　　1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

　　2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。

　　3.离心，1000 rpm，5 min。

　　4.弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养。

　　5.次日更换一次培养液，继续培养。

　　冻存和复苏的原则：慢冻快融

　　当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。

　　如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。

　　慢冻程序

　　1.标准程序：采用细胞冻存器

　　当温度在-25℃以上时，1~2℃/min；

　　当温度达-25℃以下时，5~10℃/min；

　　当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中。

　　2.简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1~2℃的速度，在40 min内降至液氮表面过夜，次晨投人液氮中。

　　3.传统程序：冷冻管置于4℃10分钟→-20℃30分钟→-80℃16~18小时（或隔夜）→液氮槽长期储存。

　　No.4、细胞计数及存活测试

　　1、原理：

　　(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。

　　(2)血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。

　　(3)存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。

　　2、材料：

　　0.4%w/v trypan blue；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish、0.05gram preservative methyl paraben溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。

　　3、步骤：

　　(1)取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。

　　(2)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。

　　(3)计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。

　　注：

　　4大格细胞总数×稀释倍数×10 4/4=细胞数/ml

　　每一大格的体积

　　=2.5px×2.5px×0.25px=10-4ml

　　计数板计数时，最适浓度为5～10×10 5细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。

　　注意要点：

　　1、冷冻越慢越好，复苏越快越好。

　　2、与液氮接触的操作，注意戴保护眼镜和手套。细胞复苏时，水浴中摇动小瓶易爆炸。且DMSO为有毒致癌品，接触时带好手套。

　　3、冻存细胞数量要足够，一般最低要达到5x10^6/ml。浓度视情况而定。

　　4、做好标记：培养瓶上应该用马克笔做好标记，写上细胞名称、代数和冻存时间。

　　5、对刚复苏的细胞动作要轻柔，避免细胞破裂。

　　6、DMSO对大多数细胞不敏感，所以解冻之后不需要除去DMSO，解冻后频繁换液会慢慢除去DMSO。部分对DMSO敏感的细胞需要除去DMSO。

　　7、解冻后的细胞要用和以前一样的培养液和血清，突然换不一样的培养液和血清会造成细胞生长不良，甚至死亡。