HUVEC人脐静脉内皮细胞培养要点及血管形成实验与

　　HUVEC人脐静脉内皮细胞来源于人静脉内皮，可在半固体培养基中形成克隆，在免疫抑制小鼠中不能形成肿瘤。

　　细胞特性

　　1）来源：人脐带组织

　　2）形态：内皮细胞样贴壁生长

　　3）含量：1x106细胞数

　　4）规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

　　5)用途：仅供科研使用。

　　HUVEC细胞系血管形成能力验证

　　1.实验方法：

　　（1）将对数生长期的HUVEC细胞系进行无血清饥饿处理16-24h。

　　（2）从冰箱中提前取出基质胶放入4℃的冰箱中过夜解冻，移液管或枪头需提前预冷，使用预冷的移液管或枪头混合基质胶至均匀状态。

　　（3）稀释基质胶，使用培养液将基质胶1：1混合均匀稀释到10 mg/mL，可根据实际情况进行调整。将完全解冻的基质胶放至在冰上，翻转几次以混合内容物后，48孔板中每孔加入150-200μL。

　　（4）将加入了基质胶的48孔板转移到4℃冰箱中，在平整状态下孵育过夜，使基底膜形成凝胶并自流平，第二天使用前提前置于37℃使基质胶固化。

　　（5）对饥饿处理后达到80%融合的HUVEC细胞进行消化，离心，计数。

　　（6）将细胞重悬在各组别培养基中，使浓度为每毫升含2~3E5个细胞的单细胞悬液。48孔板中每孔加入含待测样本的200μL细胞悬液（含4~6E4个细胞）。

　　（7）将孔板置于37℃，5%CO2，90%湿度条件的培养箱培养，并在不同时间点拍照观察，一般3-12小时可见血管网络形成，成管时间与细胞状态密切相关。

　　2.成血管实验注意要点：

　　（1）基质胶(货号：GUOR-R002)非常容易形成凝胶状态，在解冻过程中全程放在4℃，（可提前一天放置在4℃冰箱解冻预冷，准备一个-20℃的冰盒，将基质胶放置在冰盒上），在48孔板移液过程中全程在冰上操作。因此移液枪头也需要提前放至4℃预冷，也可将需要预冷的材料放至-20℃急冻。

　　（2）在向孔板中铺胶时，小心且垂直地将液体移入孔中，避免基质胶液体中出现气泡。如果出现气泡，将孔板在4℃下以300×g离心10 min，确保离心机预冷至4℃。实验过程中的所有耗材均需要提前放置在4℃冰箱中预冷。

　　（3）在37℃凝胶期间不要摇晃平板，因为这将导致凝胶表面不均匀。

　　（4）凝胶形成后先观察凝胶的形成状态，常会出现类似沙丘的隆起和沟壑，这时需要静置更长的时间，确保凝胶表面是平整均匀的状态后再进行实验。

　　（5）在接种细胞时，细胞活率要大于95%才可用于实验并得到一个准确的结果。

　　（6）当将细胞添加到孔中时，要确保细胞混合均匀，因为细胞密度对管的形成有影响。在加入细胞时，不要接触凝胶的表面，并缓慢地加入细胞悬液，以免损伤凝胶材料。

　　（7）在实验的第一个小时，不要摇动平板或将其从细胞培养箱中取出。在显微镜下观察平板时，不要在细胞培养箱外保存超过一两分钟。

　　（8）如需对成管进行荧光染色，荧光孵育时注意孵育时间，时间过长可能导致细胞弥散。

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