人布鲁氏菌病的实验室诊断方法与临床应用

　　布鲁氏杆菌（Brucella）是兼性细胞内革兰染色阴性杆菌，可以在多种野生动物和家畜体内存活。目前已经确认的布鲁菌属有12种，其中对人具有致病性的主要有4种，即牛种布鲁氏菌（B.abortus）、羊种布鲁氏菌（B.melitensis）、猪种布鲁氏菌（B.suis）和犬种布鲁氏菌（B.canis）。其中，羊种侵袭力和致病力最强，最易引起人类布鲁菌病暴发和流行。

　　布鲁氏菌病是目前最普遍的人畜共患传染病之一，其往往先于野生动物或家畜中传播，随后波及到人类。传播途径主要是接触病畜的流产物、分泌物、排泄物、内脏、皮毛以及被污染的水、食物、尘埃等，经体表皮肤黏膜、消化道、呼吸道感染。有研究表明，输血、骨髓移植、母乳喂养以及性行为等也可引起布鲁氏菌病在人与人之间的传播。全世界每年新发病例数超过50万，我国几乎每个省市区的人畜中均有不同程度的流行，其中，以畜牧业为主的北方地区发病率明显高于其他地区。

　　布鲁氏菌病临床表现多样，包括发热、多汗、肌肉和关节酸疼、乏力兼或肝、脾、淋巴结肿大和睾丸肿大等。人感染布鲁氏杆菌后，若不及时治疗，易转为难以治愈的慢性患者，给公众健康和社会经济带来严重负担。因此，快速、准确诊断人布鲁氏菌病，意义尤为重要。目前，人布鲁氏菌病的实验室诊断技术主要包括以下三类：培养、血清学和核酸扩增技术。

　　01细菌培养与鉴定

　　传统的细菌培养技术是布鲁氏菌鉴定的“金标准”。细菌培养的标本主要取自血液、骨髓，也可取自脓液、组织、脑脊液、关节腔液、胸水和腹水等。在实际临床应用中，由于细菌营养要求高，培养耗时长，实验室安全级别要求高等因素，一定程度限制了细菌培养方法的应用。

　　布鲁氏菌是高致病微生物，也是最常见的感染实验室人员的病原菌之一，其主要感染途径包括：吸入了实验操作中布鲁氏菌培养物产生的气溶胶；皮肤直接接触感染性标本或培养物；实验操作中意外针刺，或感染物飞溅到口腔、鼻腔、眼睛等粘膜。因此，对于怀疑带有布鲁氏菌的临床标本（如：血液、组织标本等），应在BSL-2实验室的II级生物安全柜中操作，通过使用个人防护装置、严格遵守标准化的操作规程等，正确处理医疗废弃物，确保实验室工作人员不受感染。

　　布鲁菌病感染人体后，细菌最初局限于局部淋巴结，然后通过血液传播，进入富含巨噬细胞的组织中，如：肝脏、脾脏、淋巴结和骨髓等，通过兼性和隐蔽的细胞内寄生方式，逃避宿主免疫反应及抗生素的作用。由于布鲁氏菌感染人体后产生菌血症，因此，外周血培养是对人布鲁氏菌病进行诊断的有效方法。影响血培养阳性率的因素有很多（表1）。不同的研究报告显示，布鲁氏菌血培养的阳性率差异较大（10%～90%）。一般而言，急性期患者患有持续性、低水平菌血症，此时，布鲁病菌血培养阳性率可达到80%～90%。随着病程延长，血液中的细菌逐渐被清除或被巨噬细胞吞噬，使得循环细菌的数量逐渐减少，血培养阳性率也随之降低。

　　除血液外，骨髓、脓液、组织、脑脊液、关节腔液等也可作为布鲁氏菌培养的标本来源。这些组织或无菌体液样本应严格按照无菌操作进行标本采集，采集后立即送至实验室，并于1～2个小时内完成接种。布鲁氏菌在临床微生物学实验室常规使用的固体培养基上生长良好，如：胰蛋白酶大豆琼脂、巧克力琼脂培养基等。一般情况下，在麦康凯培养基上不生长。布鲁氏菌生长缓慢，在血平板上经5~7天的培养，可形成微小、灰色（久置可呈黄色）、圆形、凸起的光滑性（S）菌落，经人工传代培养后可转变成粗糙型（R）菌落。

　　另外，快速、准确地鉴定培养获得的布鲁氏菌，对于早诊断和避免实验室人员感染至关重要。柯氏染色法是鉴定布鲁氏菌的经典染色方法之一，染色后的布鲁氏菌呈红色球杆状，而其它菌体形态或生长特征相似的细菌（苍白杆菌和假苍白杆菌除外）呈绿色或蓝色，常用于对布鲁氏菌的初步鉴定。传统的生化反应试验（表2），也可初步判定为布鲁氏菌。目前常见的血清学鉴定试验包括红平板凝集试验（RBPT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、试管凝集试验（SAT）、补体结合试验（CFT）、抗人免疫球蛋白试验（Coomb’s）等。近年来，MALDI-TOF技术迅速发展，并广泛应用于微生物快速鉴定，具有操作简单、快速、准确、高通量的特点。随着参照数据库的不断更新和完善，MALDI-TOF已能够准确鉴定常见的三种布鲁氏菌属：B.melitensis、B.abortus和B.suis。

　　用于人布鲁氏菌病诊断的核酸扩增方法包括普通PCR（conventional PCR）、巢氏PCR（nested PCR）、PCR-酶联免疫法（PCR-enzyme immunoassay，PCR-EIA）、实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）、多重PCR（multiplex PCR）等。近年来，环介导等温扩增技术(LAMP)也被用于人布鲁氏菌病的诊断。

　　除此之外，核酸扩增技术还广泛用于细菌分型，可为人间布鲁氏菌病精准防控、暴发疫情分析及流行病学溯源提供科学依据。用于鉴定布鲁氏菌种水平和基因分型的方法包括：（1）荧光原位杂交（FISH）：靶向16S rRNA基因，快速、准确检测所有对人类有致病性的布鲁氏菌属；（2）基于recA基因的新型PCR方法：用于区分布鲁氏菌属和苍白杆菌属，后者属于布鲁氏菌科，与布鲁氏菌有着较近的系统发育关系；（3）AMOS PCR：用于区分B.abortus、B.melitensis、B.ovis和B.suis；（4）Bruce多重PCR：能够识别并准确区分感染株和疫苗株。⑤全基因组测序：通过SNPs分析区分多种布鲁氏菌属。

　　04结论

　　总之，人布鲁氏菌病的实验室诊断技术主要包括：基于细菌培养的直接诊断、基于血清学检测的间接诊断和基于核酸扩增技术的快速诊断。我们相信，基于One Health理念，未来人布鲁氏菌病的实验室诊断技术一定会取得新突破。

　　02血清学诊断

　　血清学诊断与直接检测活体细菌的细菌培养技术或检测细菌特异DNA序列的分子诊断技术相比，血清学检测不能提供微生物存在的直接证据。该方法分初筛试验和确诊试验两类（表3）。其中，实验室初筛方法包括RBPT、胶体金免疫层析试验（GICA）、ELISA等；实验室确诊方法包括SAT、CFT、Coomb’s试验等。人布鲁氏菌病血清学诊断存在一定缺点，然而，由于方法相对简单、成本低和阴性预测值高，目前仍然是人布鲁氏菌病的主要诊断方法。

　　03核酸扩增技术

　　分子生物学检测方法已取得了很大进展，核酸扩增技术已广泛应用于布鲁氏菌病的诊断。该技术具有高灵敏度和特异性的特点，几小时内可完成布鲁氏菌病的诊断。核酸扩增检测报告的解读需结合流行病学和临床症状。

　　与传统细菌培养一样，核酸扩增技术可从多种类型的生物样本中检测布鲁氏菌，如：全血、血清、福尔马林固定-石蜡包埋组织样本等。血清样本是核酸扩增技术诊断人布鲁氏菌病首选的样本类型。其他样本类型（例如：泌尿生殖系统、骨关节系统、心血管系统和中枢神经系统）在细菌培养阴性的情况下，可用于局灶性布鲁氏菌病的诊断。另外，在DNA提取质量保证的前提下，从手术活检样本来源的福尔马林固定-石蜡包埋组织也可用于检测布鲁氏菌。

　　基于核酸扩增技术诊断人布鲁氏菌病的特异性靶基因主要包括外膜蛋白编码基因（omp2、omp31和omp28）、16S rRNA、插入序列IS711、免疫原性膜蛋白编码基因bcsp31等。有研究表明，16SrRNA基因存在交叉反应，而插入序列IS711在一些菌株中存在变异或缺失，导致结果不可靠。表6为基于核酸扩增技术诊断人布鲁氏菌病时常用的靶基因和引物。