影响细胞转染效率的因素有哪些？

　　影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，都需要先对转染条件进行优化。

　　1.转染试剂：不同细胞系转染效率通常不同，在转染实验前需要根据细胞特性选择合适的转染试剂。可以通过已发表文献和转染试剂提供的已成功转染的细胞株来选择适合的转染试剂。

　　2.转染方法：目前有多种方式能够实现细胞转染，如磷酸钙法，电穿孔法，脂质体转染法、逆转录病毒法等。不同的转染方式其转染效率也不尽相同，需要根据细胞的性质及不同的操作手法，摸索最佳的转染条件。

　　3.细胞状态：转染前细胞活力和健康状况是转染产生变异性的重要来源。最适合转染的细胞是复苏经过几次传代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。为确保转染的重复性，一般选择低细胞代次（一般<30，能确保基因型不变）。

　　4.载体类型：质粒DNA是最常用的转染载体。转入的基因产物对细胞不能有毒害作用，还需选择强度合适的启动子，可以转染空载体作为对照排除毒性对细胞的影响。病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主。

　　5.细胞培养基：不同的细胞都有特定的培养基、血清、补充剂要求，选择最适合细胞的培养基在转染实验中起着非常重要的作用。

　　6.血清：大部分转染试剂可以在有血清存在的培养基进行转染。但使用阳离子脂质体转染时，一些血清蛋白会干扰复合物的形成，因此应在无血清条件下制备DNA-脂质体复合物。当使用RNA转染细胞时，建议在无血清条件下转染，以避免潜在的RNase污染。

　　7.细胞密度：转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低。一般转染时，贴壁细胞密度为70%-90%，悬浮细胞密度为2*10^6--4*10^6细胞/ml时效果较好。

　　8.质粒纯度：如果质粒不纯，存在少量盐离子、蛋白、代谢物污染等都会影响转染复合物的形成，并且含有内毒素的质粒对细胞存在很大的毒性作用。

　　9.抗生素：细胞培养过程中往往会添加抗生素来预防污染，如青霉素和链霉素。抗生素一般对真核细胞无毒，但转染过程中细胞通透性增加，使抗生素进入细胞，从而降低细胞活性，导致转染效率低。

　　注意事项

　　在进行细胞转染实验时，需要认真筛选条件和方法，注意细节操作，并严格按照实验计划进行，以确保实验结果的准确性和可靠性。

　　在转染前，必须确保细胞状态良好，避免细胞过早或过度增殖，不建议为了赶实验周期，而使用生长状态不稳定或较差的细胞强行转染。

　　建议正式转染前先做转染预实验，摸索最合适于细胞的转染方法及转染体系，尤其原代细胞、悬浮细胞、淋巴细胞等，不建议所有细胞使用一个转染操作标准。

　　转染时设置阳性和阴性对照实验，可以帮助确定转染效率和细胞毒性。对照实验可以包括转染绿色荧光蛋白或无相关蛋白的质粒，以检验转染效率和蛋白表达情况。

　　转染时使用的质粒必须用无内毒素质粒提取试剂盒进行提取，病毒包装的质粒建议采用非过滤柱型无内毒素质粒提取试剂盒进行提取，如艾科瑞生物的无内毒素质粒提取试剂盒AG21028（阴离子交换树脂原理）。

　　转染后6h左右最好换液且换为有血清的培养基，其一是因为普通转染试剂对细胞有一定的毒性作用，其二可降低因血清的缺乏引起的细胞的死亡。

　　转染效率的验证

　　一般在转染后24-48h，靶基因就可在细胞内表达。可依据不同的实验目的，24-48h后即可进行靶基因表达的检测等实验。

　　转染完成后需要对转染效率进行检测，常用的转染效率检测方法有[5]：

　　1.使用荧光显微镜或流式细胞仪可以测定转染细胞和荧光蛋白表达细胞的百分比。

　　2.利用qPCR法精确检测转染后细胞中靶基因的mRNA的表达水平。

　　3.WB检测细胞中敲除或者过表达蛋白的表达水平。