小鼠单细胞悬液制备之脾脏组织

一、实验前准备

1. 材料准备

   • 小鼠：选择合适品系和健康状态的小鼠。

   • 手术器械：包括眼科剪、眼科镊等，需要提前消毒，可采用高压蒸汽灭菌，防止微生物污染样本。

   • 培养皿：最好是无菌一次性塑料培养皿。

   • 细胞筛：70μm 细胞筛用于过滤细胞团块，保证得到单细胞悬液。

   • 离心管：15ml 或 50ml 的无菌离心管，用于收集和离心细胞。

   • PBS 缓冲液（磷酸盐缓冲生理盐水）：用于清洗细胞，其配方一般为 137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na₂HPO₄、2mM KH₂PO₄，pH 值为 7.4 左右，需要提前配制并灭菌。

   • 红细胞裂解液：用于去除红细胞，例如可以使用 ACK 裂解液（氯化铵 - 碳酸氢钾裂解液），其主要成分是 NH₄Cl、KHCO₃和 EDTA，配方一般是 8.29g/L NH₄Cl、1.0g/L KHCO₃和 0.0372g/L EDTA，pH 值为 7.2 - 7.4。

2. 环境准备

   • 实验最好在无菌的细胞培养室或者超净工作台中进行，提前开启紫外线照射消毒 30 分钟以上，并且用 75% 乙醇擦拭台面。

 

二、脾脏获取

1. 小鼠处死

   • 采用颈椎脱臼法处死小鼠，操作时要迅速而准确，避免小鼠过度痛苦，同时也要防止血液流入脾脏造成污染。

2. 解剖

   • 将小鼠仰卧固定在解剖板上，用 75% 乙醇喷洒小鼠腹部进行消毒。用眼科剪沿小鼠腹部正中线剪开皮肤和肌肉，暴露腹腔。小心地取出脾脏，尽量保持脾脏完整，避免撕裂。将脾脏转移到预先装有适量预冷 PBS 缓冲液的培养皿中。

 

三、细胞分离

1. 研磨脾脏

   • 在装有脾脏的培养皿中，用无菌的眼科剪将脾脏剪成小块，大小尽量均匀，约 1 - 2mm³。然后用注射器的活塞或者研磨棒轻轻研磨脾脏小块，使细胞从脾脏组织中释放出来。这个过程要轻柔，避免细胞受损。

2. 过滤细胞悬液

   • 将研磨后的细胞悬液通过 70μm 细胞筛过滤到新的离心管中，去除未研磨碎的组织块和细胞团。可以用少量 PBS 缓冲液冲洗细胞筛，以保证尽可能多的细胞通过。

3. 离心收集细胞

   • 将过滤后的细胞悬液在 4℃、300 - 500g 离心 5 - 10 分钟，使细胞沉淀在离心管底部。离心速度和时间的选择要根据细胞的特性和实验要求来确定，避免离心力过大对细胞造成损伤。

4. 红细胞裂解

   • 弃去上清液，加入适量的红细胞裂解液（一般每 10⁷个细胞加入 1 - 2ml 裂解液），轻轻重悬细胞沉淀，在室温下孵育 3 - 5 分钟，期间可以轻轻颠倒离心管几次，使红细胞充分裂解。但要注意不要孵育时间过长，以免影响其他细胞的活性。

5. 终止裂解和清洗细胞

   • 加入等体积的预冷 PBS 缓冲液终止红细胞裂解，然后在 4℃、300 - 500g 离心 5 - 10 分钟，弃去上清液。重复用 PBS 缓冲液清洗细胞 1 - 2 次，以彻底去除红细胞裂解产物和其他杂质。

 

四、细胞重悬和计数

1. 细胞重悬

   • 最后，用适量的培养液或者合适的缓冲液（如 RPMI - 1640 培养基等）重悬细胞沉淀，使细胞分散均匀，得到单细胞悬液。

2. 细胞计数

   • 可以使用血细胞计数板或者自动细胞计数仪来计数细胞。根据实验的需要调整细胞浓度，以便进行后续的实验，如细胞培养、流式细胞术等。

 

通过以上步骤，就可以制备出小鼠脾脏细胞的单细胞悬液，为后续的细胞生物学实验提供合适的细胞样本。