上海安为生物科技有限公司
入驻年限：3 年
- 联系人：
许飞
- 所在地区：
上海 奉贤区
- 业务范围：
细胞库 / 细胞培养、试剂、抗体、ELISA 试剂盒、技术服务、耗材
- 经营模式：
生产厂商 代理商 经销商 科研机构
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技术资料/正文
细胞系复苏、传代与冻存操作流程
3703 人阅读发布时间：2022-06-08 16:01
细胞系收货指南
壹．收到细胞后的操作说明（重要）
1）收货前根据说明书培养条件，提前准备细胞培养所需材料。
2） 收到细胞后，请检查发货培养瓶的状况，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。
3） 收货后没有外观损坏的情况下用75%酒精消毒后将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h等待细胞稳定。
4） 细胞稳定后在显微镜下确认细胞生长状态，判断细胞的密度并清晰拍照记录反馈细胞状态以防出现售后作为证据。
5） 贴壁细胞：在运输过程中由于运输颠簸贴壁细胞会有脱落的现象，如发现有脱落或者脱落后抱团生长，可将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和未贴壁细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶或者培养皿中，按照说明书细胞培养条件加入新配制的完全培养基。
6） 悬浮细胞：T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基）。
备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。当密度达到80%左右， 传代比例前几次都按照1:2传代，传代后一个倍增周期后可以长成2瓶80%左右密度的细胞时，冻存其中一瓶成1个1ml的冻存管当种子细胞保存，另外一份长满的细胞继续1:2传代，反复操作后冻存细胞种子大约3个以上。 后续根据细胞倍增效率和密度可以适当扩大传代比例做实验。
传代比例：
1个T25瓶传2个6cm的培养皿或者2个T25瓶 相当于1:2
1个T25瓶传1个10cm的培养皿或者1个T75瓶 相当于1:3
贰．售后服务告知书
一、收到细胞处理方法
1. 收到细胞先不开瓶盖，瓶身擦拭酒精后放在培养箱静置 2 小时（视细胞密度而定）稳定细胞状态，悬浮细胞不需要静置直接按照悬浮细胞步骤操作。接着在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收细胞时就整体外观拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，随后在显微镜下拍下细胞状态，100×，200×各 2 张），观察记录细胞在运输过程中是否有污染情况。作为我方进行售后的依据。
2. 收到细胞未开封，出现污染状况我们负责免费重发一次细胞。
3. 由于细胞状态受环境、操作和运输等多方面因素的影响，故本公司只保证客户收到细胞后一周内的细胞状态，故客户需要售后是需出示收到细胞的时间证明及客户提供收货时间和发现问题后与客服人员沟通的时间证明，期间间隔时间不能大于 7 天。
4. 如客户对细胞的种类、纯度、活性等特性有疑问，需在收到细胞 2 个月之内提供相应的生物学实验检测结果作为依据。经我们技术确定细胞确实有问题的，我们只对细胞本身负责，不对客户进行其他任何补偿。经检测有部分细胞有个别多等位点突出的不在售后范围之内的。
二、细胞出现问题，可重发的情况有哪些？判定标准是什么？
1. 细胞运输途中遭遇的各种问题，细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等，重发；
2. 细胞污染问题，请在收到产品 3 天内，给我们提出真实的实验结果，核实后重发；
3. 常温发货的细胞静置 2 小时后，干冰冻存发货的细胞复苏后 2 天后，绝大多数细胞未存活，（需提供真实清晰的细胞状态照片），重发；
4. 干冰冻存发货的细胞复苏 2 天后或常温发货的细胞静置 2 小时并且未开封，出现污染，重发；
5. 细胞活性问题，请在收到产品 7 天内给我们提出真实的实验结果，用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，核实后予重发；
6. 细胞收到当天以及第 2,3 天请拍照，3 天未告知的，视为产品合格。4-7 天内出现问题有提供收到细胞前 3 天照片和细胞出现问题时照片以及细胞相关操作的详细步骤的，并跟技
术人员沟通的，由技术人员判定为我方责任的，重发。技术人员判定为双方承担责任的由双方进行协商处理或者按合同价的 50%收费重发。
三、细胞出现问题，不予以重发的情况有哪些？
1. 客户操作造成细胞污染，不重发；
2. 客户严重操作失误致细胞状态不好，不重发；
3. 非我们推荐细胞培养体系致的细胞状态不好，不重发；
4. 细胞状态不好，未提供真实清晰的培养前 3 天的细胞状态照片，不重发；
5. 细胞培养时经其它处理导致细胞出现问题的，不重发；
6. 收到细胞发现问题与客服人员沟通的时间证明大于 7 天的，不重发；
7. 视具体情况而定。 四、其他服务政策
1. 细胞出现问题后，未能及时反馈并提交细胞质量问题反馈表的，不能免费重发，如需重发，
客户需与公司销售人员协商经双方定价后给予重发。原代细胞的重发没有库存的，须经技
术人员同意后，定下货期再通知客户。
叁．细胞复苏、传代与冻存操作流程
冻存液：90%FBS或者完全培养基+10%DMSO 或者使用成品正规厂家无血清冻存液均可冻存发货的细胞 常规常见细胞 冻存管2只。
我们建议客户先复苏1只，存活的话第二只当种子保存，第一只没有存活再严格按照我们的要求复苏第二只，如果还不成功 第一时间反馈细胞复苏的详细信息给我们。
操作流程：
复苏
传代 （细胞传代建议一传二）
① 准备一个无菌的15ml离心管，加入2ml含10%FBS的完全培养基；
② 将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和（避免吹打）；
③ 向之前消化的培养瓶中加入1ml胰酶继续消化2min左右（除贴壁非常牢固的细胞外。比如RAW264.7等消化时间可以长点，其他细胞尽量缩短消化时长，可以减少胰酶对细胞膜的损伤，有助于维持细胞系的状态持续稳定，降低老化速度），轻拍培养瓶，95%左右细胞脱落后加入2ml含10%FBS的完全培养基中和，中和后的细胞悬液移入①中的离心管内。
冻存（细胞冻存建议每瓶T25冻一支）
壹．收到细胞后的操作说明（重要）
1）收货前根据说明书培养条件，提前准备细胞培养所需材料。
2） 收到细胞后，请检查发货培养瓶的状况，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。
3） 收货后没有外观损坏的情况下用75%酒精消毒后将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h等待细胞稳定。
4） 细胞稳定后在显微镜下确认细胞生长状态，判断细胞的密度并清晰拍照记录反馈细胞状态以防出现售后作为证据。
5） 贴壁细胞：在运输过程中由于运输颠簸贴壁细胞会有脱落的现象，如发现有脱落或者脱落后抱团生长，可将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和未贴壁细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶或者培养皿中，按照说明书细胞培养条件加入新配制的完全培养基。
6） 悬浮细胞：T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基）。
备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。当密度达到80%左右， 传代比例前几次都按照1:2传代，传代后一个倍增周期后可以长成2瓶80%左右密度的细胞时，冻存其中一瓶成1个1ml的冻存管当种子细胞保存，另外一份长满的细胞继续1:2传代，反复操作后冻存细胞种子大约3个以上。 后续根据细胞倍增效率和密度可以适当扩大传代比例做实验。
传代比例：
1个T25瓶传2个6cm的培养皿或者2个T25瓶 相当于1:2
1个T25瓶传1个10cm的培养皿或者1个T75瓶 相当于1:3
贰．售后服务告知书
一、收到细胞处理方法
1. 收到细胞先不开瓶盖，瓶身擦拭酒精后放在培养箱静置 2 小时（视细胞密度而定）稳定细胞状态，悬浮细胞不需要静置直接按照悬浮细胞步骤操作。接着在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收细胞时就整体外观拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，随后在显微镜下拍下细胞状态，100×，200×各 2 张），观察记录细胞在运输过程中是否有污染情况。作为我方进行售后的依据。
2. 收到细胞未开封，出现污染状况我们负责免费重发一次细胞。
3. 由于细胞状态受环境、操作和运输等多方面因素的影响，故本公司只保证客户收到细胞后一周内的细胞状态，故客户需要售后是需出示收到细胞的时间证明及客户提供收货时间和发现问题后与客服人员沟通的时间证明，期间间隔时间不能大于 7 天。
4. 如客户对细胞的种类、纯度、活性等特性有疑问，需在收到细胞 2 个月之内提供相应的生物学实验检测结果作为依据。经我们技术确定细胞确实有问题的，我们只对细胞本身负责，不对客户进行其他任何补偿。经检测有部分细胞有个别多等位点突出的不在售后范围之内的。
二、细胞出现问题，可重发的情况有哪些？判定标准是什么？
1. 细胞运输途中遭遇的各种问题，细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等，重发；
2. 细胞污染问题，请在收到产品 3 天内，给我们提出真实的实验结果，核实后重发；
3. 常温发货的细胞静置 2 小时后，干冰冻存发货的细胞复苏后 2 天后，绝大多数细胞未存活，（需提供真实清晰的细胞状态照片），重发；
4. 干冰冻存发货的细胞复苏 2 天后或常温发货的细胞静置 2 小时并且未开封，出现污染，重发；
5. 细胞活性问题，请在收到产品 7 天内给我们提出真实的实验结果，用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，核实后予重发；
6. 细胞收到当天以及第 2,3 天请拍照，3 天未告知的，视为产品合格。4-7 天内出现问题有提供收到细胞前 3 天照片和细胞出现问题时照片以及细胞相关操作的详细步骤的，并跟技
术人员沟通的，由技术人员判定为我方责任的，重发。技术人员判定为双方承担责任的由双方进行协商处理或者按合同价的 50%收费重发。
三、细胞出现问题，不予以重发的情况有哪些？
1. 客户操作造成细胞污染，不重发；
2. 客户严重操作失误致细胞状态不好，不重发；
3. 非我们推荐细胞培养体系致的细胞状态不好，不重发；
4. 细胞状态不好，未提供真实清晰的培养前 3 天的细胞状态照片，不重发；
5. 细胞培养时经其它处理导致细胞出现问题的，不重发；
6. 收到细胞发现问题与客服人员沟通的时间证明大于 7 天的，不重发；
7. 视具体情况而定。 四、其他服务政策
1. 细胞出现问题后，未能及时反馈并提交细胞质量问题反馈表的，不能免费重发，如需重发，
客户需与公司销售人员协商经双方定价后给予重发。原代细胞的重发没有库存的，须经技
术人员同意后，定下货期再通知客户。
叁．细胞复苏、传代与冻存操作流程
冻存液：90%FBS或者完全培养基+10%DMSO 或者使用成品正规厂家无血清冻存液均可冻存发货的细胞 常规常见细胞 冻存管2只。
我们建议客户先复苏1只，存活的话第二只当种子保存，第一只没有存活再严格按照我们的要求复苏第二只，如果还不成功 第一时间反馈细胞复苏的详细信息给我们。
操作流程：
复苏
- 将恒温水浴锅中的水预热到37℃；
- 准备一支15ml离心管，加入5ml含10%FBS的完全培养基，放入37℃水浴锅中预热；
- 戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率；
- 将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中，混匀后，1000rpm离心5min；
- 准备一个T-25培养瓶，写上细胞名称、日期，再加入4ml完全培养基；
- 离心完成后弃去上清，用1ml完全培养基重悬细胞后，转入T-25细胞培养中，混匀后转入CO2培养箱中培养静置。
传代 （细胞传代建议一传二）
- 当细胞汇合度达到85%以上时，可进行传代。
- 在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，收集瓶内的培养基；
- 向培养瓶内加入3ml无菌的1×PBS 后，水平放置培养瓶，使PBS能够浸润到培养瓶底面上所有的面积，吸弃PBS；
- 向瓶内加入消化液1ml，浸润底面后放入37℃ CO2培养箱中孵育1~2min；
- 孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若全部消化下来则直接向培养瓶内加入2ml含10%FBS的完全培养基中，将悬液吸入15ml离心管；
① 准备一个无菌的15ml离心管，加入2ml含10%FBS的完全培养基；
② 将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和（避免吹打）；
③ 向之前消化的培养瓶中加入1ml胰酶继续消化2min左右（除贴壁非常牢固的细胞外。比如RAW264.7等消化时间可以长点，其他细胞尽量缩短消化时长，可以减少胰酶对细胞膜的损伤，有助于维持细胞系的状态持续稳定，降低老化速度），轻拍培养瓶，95%左右细胞脱落后加入2ml含10%FBS的完全培养基中和，中和后的细胞悬液移入①中的离心管内。
- 1000rpm离心5min；
- 准备两个新的T-25培养瓶，各加入4ml完全培养基。
- 离心完成后，弃上清，用2ml完全培养基重悬离心细胞，将重悬后的细胞转入2个T-25培养瓶，每个培养瓶各1ml；
- 水平放置培养瓶，震荡混匀后，将培养瓶置于37℃，5%CO2培养箱中静置培养。
- 每次消化不超过2min，如果消化2min后，培养瓶中还有较多细胞贴壁，可采用分步消化，将消化下来的细胞移入15mL离心管中和，再向培养瓶中加入胰酶继续消化，每次消化不超过2min，直到完全消化下来为止。
- 细胞传代建议1传2，前期传代后冻存一份细胞，另外一份细胞继续扩增，确保细胞种子保留好之后可以扩大传代比例。
- 特殊细胞贴壁特别牢固的也可以采用长时间消化法或者物理细胞铲（刮）把细胞消化或者刮下来，比如巨噬类细胞。
- 有一些细胞属于半贴壁生长，收货后一部分贴壁，还有一部分悬浮的情况下，注意不要把悬浮的细胞全部抽掉不要，或许还是活细胞，应该根据密度数量情况决定是否需要收集起来和贴壁一重新铺瓶。
冻存（细胞冻存建议每瓶T25冻一支）
- 将需要那冻存的细胞从CO2培养箱中取出，在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，吸弃瓶内的培养基；
- 向培养内加入无菌1×PBS 3ml，之后水平放置培养瓶，旋转震荡培养瓶，使PBS能够浸润到培养平面上所都的面积，吸弃PBS；
- 重复步骤2一次，之后向瓶内加入消化液2ml，轻微震荡后放入37℃ CO2培养箱中孵育1min左右；
- 孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，如还有部分细胞未消化下来，可在生物安全柜内用移液管吸起消化液，吹打培养平面；
- 向消化下细胞的培养瓶中加入3ml含10%血清的完全培养基终止消化，然后将培养瓶中的液体转入15ml离心管中，300g离心5min；
- 离心完成后，弃上清，用1mL冻存液重悬细胞沉淀，然后转入1.8ml冻存管中；
- 将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；
- 第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。
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