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羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒说明书 微量法
人阅读 发布时间：2023-09-18 17:04
羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒说明书
微量法
注意：正式测定之前务必取2-3个预期差异大的样本做预测定。
微信 13321108309
规格：100T/96S
产品内容：
提取液：6mol/L 盐酸，自备。浓盐酸：H2O（V/V）= 1:1，室温保存。
试剂一：液体8mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂二：液体8mL×1 瓶，4℃避光保存。
标准品：0.5mL×1 支，0.5mg/mL 羟脯氨酸标准品，4℃保存。
产品说明：
HYP 是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。
样品经水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T 氧化，氧化产物与对二甲醛反应，产生红色化合物，在560nm 处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm 吸光值，可计算HYP 含量。
自备实验用品及仪器：
天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、6mol/L 盐酸和蒸馏水。
操作步骤：
一、羟脯氨酸提取：
1、组织：称取约0.2g 样品于玻璃管，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭。加入2mL 的提取液，煮沸或110℃烘箱2 至6 小时消化至没有可见大的团块，16000rpm，25℃，离心20min（若离心后仍有杂质，可通过过滤去除），用10mol/L NaOH（约1mL）调节pH 值至6～8 范围内。蒸馏水定容至4mL，取上清待测。（过程中可能有黑色物质生成，若长时间不能消化，可能为碳化的物质）
2. 细胞：取500 万个细胞，加入1mL 的提取液，煮沸或110℃烘箱2 至6 小时消化至透明状，16000rpm，25℃，离心20min，用10mol/L NaOH（约0.5mL）调节pH 值至6～8 范围内。蒸馏水定容至2mL，取上清待测。
二、测定操作：
1. 分光光度计或酶标仪预热30min 以上，调节波长至560nm，蒸馏水调零。
2. 将标准品稀释为30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234μg/mL 的标准溶液。
3. 操作表
三、羟脯氨酸含量计算公式：
1. 标准曲线的绘制：
以标准溶液的浓度为x 轴，ΔA 标准（ΔA =A 标准管-A 空白管）为y 轴，绘制标准曲线，得到方程y=kx+b。将ΔA（ΔA =A 测定管-A 空白管）带入方程得到x。
2. 羟脯氨酸含量的计算：
（1）按样本鲜重计算：
组织羟脯氨酸含量（μg/g 鲜重）= x×V 样品÷（W×V 样品÷V 组提）=4x÷W。
（2）按样本蛋白浓度计算：
组织羟脯氨酸含量（μg/mg prot）= x×V 样品÷（Cpr×V 样品）=x÷Cpr。
（3）按细菌或细胞数量计算：
细胞羟脯氨酸含量（μg/104 cell）= x×V 样品÷（细胞数量×V 样品÷V 胞提）=2x÷细胞数量。
V 样品：加入的样品体积，0.06mL；V 组提：组织提取液体积，4mL；V 胞提：细胞提取液体积，2mL；W：样本鲜重，g；细胞数量：以104 为单位，万个；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。
注意事项：
1、OD 值大于1.0，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。
2、试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触。
3、按样本蛋白浓度计算时，需单独提取样本中的蛋白质并测定
微量法
注意：正式测定之前务必取2-3个预期差异大的样本做预测定。
微信 13321108309
规格：100T/96S
产品内容：
提取液：6mol/L 盐酸，自备。浓盐酸：H2O（V/V）= 1:1，室温保存。
试剂一：液体8mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂二：液体8mL×1 瓶，4℃避光保存。
标准品：0.5mL×1 支，0.5mg/mL 羟脯氨酸标准品，4℃保存。
产品说明：
HYP 是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。
样品经水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T 氧化，氧化产物与对二甲醛反应，产生红色化合物，在560nm 处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm 吸光值，可计算HYP 含量。
自备实验用品及仪器：
天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、6mol/L 盐酸和蒸馏水。
操作步骤：
一、羟脯氨酸提取：
1、组织：称取约0.2g 样品于玻璃管，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭。加入2mL 的提取液，煮沸或110℃烘箱2 至6 小时消化至没有可见大的团块，16000rpm，25℃，离心20min（若离心后仍有杂质，可通过过滤去除），用10mol/L NaOH（约1mL）调节pH 值至6～8 范围内。蒸馏水定容至4mL，取上清待测。（过程中可能有黑色物质生成，若长时间不能消化，可能为碳化的物质）
2. 细胞：取500 万个细胞，加入1mL 的提取液，煮沸或110℃烘箱2 至6 小时消化至透明状，16000rpm，25℃，离心20min，用10mol/L NaOH（约0.5mL）调节pH 值至6～8 范围内。蒸馏水定容至2mL，取上清待测。
二、测定操作：
1. 分光光度计或酶标仪预热30min 以上，调节波长至560nm，蒸馏水调零。
2. 将标准品稀释为30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234μg/mL 的标准溶液。
3. 操作表
| 空白管 | 测定管 | 标准管 | |
| 样本（μL） | 60 | ||
| 标准溶液（μL） | 60 | ||
| 试剂一（μL） | 60 | 60 | 60 |
| 混匀，室温静置 20min | |||
| 试剂二（μL） | 60 | 60 | 60 |
| H2O（μL） | 180 | 120 | 120 |
| 混匀， 60℃，20min水浴，取出后室温静置 15 min，取 200μL于微量玻璃比色皿 /96孔板中检测 A560吸光值。 ΔA=A测定管 -A空白管 | |||
三、羟脯氨酸含量计算公式：
1. 标准曲线的绘制：
以标准溶液的浓度为x 轴，ΔA 标准（ΔA =A 标准管-A 空白管）为y 轴，绘制标准曲线，得到方程y=kx+b。将ΔA（ΔA =A 测定管-A 空白管）带入方程得到x。
2. 羟脯氨酸含量的计算：
（1）按样本鲜重计算：
组织羟脯氨酸含量（μg/g 鲜重）= x×V 样品÷（W×V 样品÷V 组提）=4x÷W。
（2）按样本蛋白浓度计算：
组织羟脯氨酸含量（μg/mg prot）= x×V 样品÷（Cpr×V 样品）=x÷Cpr。
（3）按细菌或细胞数量计算：
细胞羟脯氨酸含量（μg/104 cell）= x×V 样品÷（细胞数量×V 样品÷V 胞提）=2x÷细胞数量。
V 样品：加入的样品体积，0.06mL；V 组提：组织提取液体积，4mL；V 胞提：细胞提取液体积，2mL；W：样本鲜重，g；细胞数量：以104 为单位，万个；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。
注意事项：
1、OD 值大于1.0，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。
2、试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触。
3、按样本蛋白浓度计算时，需单独提取样本中的蛋白质并测定
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