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吲哚与牛血清白蛋白的结合测定实验

人阅读 发布时间:2023-05-29 20:16

实验方法原理

平衡渗透的原理可以通过经典的实验来验证。牛血清白蛋白(BSA)是一种比较廉价的大分子物质,可以大量获得。因此可以用不太灵敏的方法来测定,而无需化学转化或放射性同位素标记。结合常数 Kd 和每个白蛋白分子上的结合位点数 n 都能有效精确地获得。然而由于这种实验方法的原因可能引起误差,实验时必须小心谨慎以减少所得数据的误差。这个实验可以和其他实验一起进行,像超滤和超速离心等。

 

血清白蛋白是血液中一种必需的运输蛋白,具有独特的结构,由一系列重复的单位组成,并最终形成三个相似的结构域,每个结构域上都有由脂肪酸、像胆红素的胆汁色素和色氨酸的结合位点(Peters,1985)。后面的结合位点可以通过这个实验来鉴定,吲哚环可以取代氨基酸。这个复合物可以用 Ehrlich's 试剂来进行定量分析,形成蔷薇吲哚(rosindole)发色团(图 1)。



图 1 吲哚和 Ehrlich's 试剂的反应

实验材料 牛血清白蛋白 吲哚
试剂、试剂盒 磷酸钾 KOH  乙醇 Ehrlich's 试剂
仪器、耗材 透析膜 订购的透析管 透析设备 光度计 玻璃比色皿
实验步骤

 

实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」

 

1. 吲哚测试和标准曲线

 

把 0.25 ml 吲哚溶液(用 0.1 mol/L pH 7.0 的磷酸钾稀释母液)、10 ul 5 mol/L KOH 和 1 ml 分别加入到 1.5 ml 反应杯中。充分摇晃反应杯,然后离心 5 min。取 0.2 ml 上层的有机相加到一个新的反应杯中,并加入 1.2 ml 稀释的 Ehrlich's 试剂。样品混合后在室温下可放置 20 min,用分光光度计在 572 nm 或 578nm 下测样品的吸光度。用 0.25 ml 0.1 mol/L pH 7.0 的磷酸钾代替吲哚做空白对照。

 

标准曲线通过 10 个不同的吲哚浓度和 1 个空白对照绘制出,由标准曲线可读出透析实验中不同的吲哚浓度。

 

2. 透析膜的处理方法

 

在实验前必须先将透析膜切成足够大的小片,使它能完全覆盖透析单元间的空腔。由于透析袋是双层的,所以必须先将透析袋从侧面切开。在使用膜片前需要先在加了 EDTA(约 5 mmol/L )的水中煮上 5 min 来完全去除重金属离子。然后用水洗透析膜,再放在透析单元中间。为了使透析膜保持湿润,在插入膜片后应迅速使透析单元充满溶液。

 

3. 最少透析时间的确定

 

准备十个透析单元,每个单元都由两部分组成,中间以透析膜隔开。每个单元右边的小室加 1 ml 5×10-4 mol/L 溶于 0.1 mol/L pH 7.0 磷酸钾的吲哚溶液,左边的小室加 0.1 mol/L pH 7.0 磷酸钾溶液。此步操作必须迅速,然后固定到旋转器上开始透析。在一定的时间间隔后,从第一个透析单元左右两边各取出 0.25 ml 的样品,在第二个同样的时间后再从第二个透析单元取同样的样品,依次类推,直到取完所有的透析单元的样品。所有的样品,连同透析前的初始吲哚溶液一同用于吲哚测试以决定浓度。左右两边样品的吸收值分别对时间作图,作出两条曲线,两条曲线相交处的时间可以作为最小透析时间,用于下面的实验。实验的时间间隔和总的时间依赖于特定的透析条件,特别是透析设备。通常应该在 2 h 内达到透析平衡,这也是实验的总时间。由于配体浓度呈指数改变,推荐使用不同的时间间隔,在实验开始时时间间隔短,在实验快结束时采用长的时间间隔。

 

4. 吲哚与血清白蛋白结合的测定

 

与上面一个实验一样至少准备 10 个透析单元。在每个圆柱体的一侧(比如右侧)加 1 ml 0.1 ml 的牛血清白蛋白(溶于 0.1 mol/L pH 7.0 的磷酸钾中)。另一侧(左侧)加满吲哚溶液,浓度范围为 2×10-5~2×10-3 mol/L 在实验前把溶液稀释好。通常结合实验的终浓度(即吲哚在两侧分布引起的双重稀释)应平均地分布在一个范围内,一个数值在分离常数以下,一个在以上(吲哚 Kd=0.08 mmol/L )。但是由于这些浓度与平衡中的自由成分 [A] 相关,为了分享结合成分,必须使用适当高浓度的配体。透析必须在常温下进行(25℃)。在透析结束(确定的最小渗透时间加上 30 min,要确保渗透平衡和蛋白已结合)后,所有小室溶液耗尽,从而确定吲哚浓度。

 

注意事项

 

其他

 

1. 材料

 

0.1 mmol/L 牛血清白蛋白(Mr=68 000;68 mg 溶于 10 ml 0.1 mol/L 磷酸 pH 7.0)

 

0.1 mmol/L 吲哚(Mr=117.2;1.17 g 溶于 100 ml 异丙醇,用 0.1 mol/L 磷酸钾 pH 7.0 进一步地稀释)

 

2. 试剂

 

0.1 mol/L 磷酸钾 pH 7.0

 

5.0 mol/L KOH(Mr=56.1;28 g 溶于 100 ml 水)

 

 

 

乙醇

 

Ehrlich's 试剂:把 9 g 对二甲甲醛溶于 205 ml 乙醇并缓慢加入 13 ml 浓硫酸(戴护目镜操作),用乙醇定容到 250 ml。使用前用 2 份乙醇稀释 1 份试剂(只储存浓缩试剂,室温下可储存数月)。

 

3. 耗材

 

透析膜,订购的透析管(例如 Visking)

 

透析设备(如上描述,由 10~20 个透析单元组成,每个单元有两个 1 ml 的圆孔,圆孔直径 12 mm,高 9 mm)。

 

光度计(可见光波长范围)

 

玻璃比色皿

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