生物发光 vs 荧光成像，怎么选？

在设计和开展动物活体成像实验时，你会发现常见有两种模式：生物发光和荧光成像。这两套模式为什么要同时存在？它们究竟有何不同，各自又发挥着怎样的作用？

要回答这些问题，我们首先得弄明白：活体成像究竟是怎么成像的。简单来说，小动物活体成像是通过某种方式让研究对象具备“发光”的能力，再利用成像设备将这些光信号采集并转化为电信号，最终生成图像。也就是说，成像的前提是让实验对象在体内有一个可以被检测到的光源，而目前常见的方式便是这两种：生物发光和荧光。

 

 

生物发光：萤火虫的光搬进实验室

生物发光成像的灵感来自自然界，萤火虫和深海鱼在黑暗中自发光的能力长期吸引着研究者。19世纪末，法国生物学家 Raphaël Dubois 提出了“荧光素（luciferin）/荧光素酶（luciferase）”的概念；而20世纪中期，William D. McElroy团队揭示了萤火虫发光的化学机制，确定这是一类依赖 ATP 的酶促反应，并成功分离出关键发光酶，至此生物自发光的机制基本明确。其核心过程是：荧光素酶催化荧光素在 ATP 和氧气作用下被氧化生成激发态的产物，随后该产物回到基态时释放光子，实现从化学能到光能的转化。

1980年代，分子生物学将该体系用于基因研究：Ow 将荧光素酶基因导入植物，de Wet 应用于哺乳动物，确立其为跨物种、高灵敏、可定量的报告基因；通过体内注射底物即可“点亮”目标细胞。

1990年代中期，这一体系首次用于活体成像。Christopher Contag团队利用细菌发光基因在小鼠体内实现非侵入成像；1997年，他们进一步将萤火虫体系用于哺乳动物，实现了活体基因表达可视化。这一突破使研究者能够动态观察肿瘤生长、基因表达及药物作用，大幅拓展了生物医学研究手段。

 

荧光成像：从水母到多色荧光

荧光成像的发展要从绿色荧光蛋白（GFP）说起。1962年，下村修在维多利亚水母（Aequorea victoria）中分离出一种在紫外光下发出绿色荧光的蛋白，并逐步解析其化学特性。1992年，Prasher克隆了 GFP 基因；1994年，Chalfie将其导入大肠杆菌和秀丽隐杆线虫，证明仅表达该基因即可在细胞内产生荧光，而无需额外底物。随后，Roger Tsien通过蛋白质工程显著提高了 GFP 的亮度和稳定性，并拓展至多种颜色变体，奠定了多色荧光成像的基础。三人也因这一系列贡献于2008年获得诺贝尔化学奖。其发光机制是：荧光分子吸收外部特定波长的光子后，电子跃迁至激发态，随后回到基态时释放出能量较低的光子，即我们检测到的荧光信号。

除基因标记外，还开发了多种小分子荧光染料（如 Cy5、Cy7、ICG 等），可与特定分子结合，经外部光源激发实现成像。成像波段也扩展至近红外 NIR-I（650–900 nm）和 NIR-II（1000–1700 nm），以提高组织穿透和信噪比，支持更深部成像。

经过前面的介绍可以看出，生物发光与荧光成像在原理和表现上差异显著。

 

生物发光和荧光成像有什么本质区别？

生物发光：依赖荧光素酶+底物的化学反应，在体内直接产生光子。无需外部光源，背景噪声极低，信噪比高，尤其适合检测低水平的基因表达或少量细胞变化。底物注射机制还能让发光的时间和部位可控。

荧光成像：依赖外部光源激发，让荧光分子电子跃迁并回到基态时释放光子，信号亮度更高，能够轻松实现多颜色、多靶点同步成像。

 

 

它们各自的优缺点是什么？

生物发光：

优点：背景噪声极低，信噪比高，非常适合检测弱信号（如低水平基因表达、少量细胞变化）。发光时机和部位可控（通过底物注射调整）。

缺点：光子产量低，整体亮度不足。空间分辨率有限，多重成像能力较弱（通常单通道）。

荧光成像：

优点：信号亮度高，图像更清晰。多颜色、多靶点成像能力强，可实现多通道同步观察。近红外波段拓展（NIR-I/NIR-II）提高组织穿透力和信噪比，支持深部成像。

缺点：背景自发荧光和散射干扰较大，需要良好的滤光与光路设计。对数据处理和校正要求高，避免假阳性或伪影。

 

 

那么，面对具体实验，该如何选择合适的成像模式呢？

什么时候优先选择生物发光成像？

①当研究重点是疾病发展趋势（如肿瘤生长、炎症扩散、感染进展）时。

②需要连续动态监测时，生物发光无需外部光源，背景噪声极低，便于多时间点跟踪。

③在基因表达或细胞存活等低信号实验中，生物发光能提供稳定、可量化的数据。

 

什么时候优先选择荧光成像？

①当研究需要精确解剖定位，如描绘肿瘤边界、显示器官结构时。

②需要多靶点同时检测（如肿瘤、血管、免疫细胞等）时，荧光的多色探针可实现多通道成像。

③研究对象位于深部组织或是低表达分子时，近红外荧光（NIR-I/NIR-II）能改善穿透和信噪比。

 

是否可以联合使用两种模式？

如果既需要整体动态信息，又要精确空间定位，联合使用生物发光和荧光成像可以获得更全面的结果。若既需要整体动态信息，又要精确空间定位，联合使用两种模式往往能获得更全面的结果。

图表.两种成像模式对比

 

 

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部分参考文献：

[1]Ow DW, Wood KV, DeLuca M, et al. Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants. Science. 1986;234(4778):856-859. doi:10.1126/science.234.4778.856

[2]Contag CH, Spilman SD, Contag PR, et al. Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter. Photochemistry and Photobiology. 1997;66(4):523-531. doi:10.1111/j.1751-1097.1997.tb03184.x

[3]Heim R, Cubitt AB, Tsien RY. Improved green fluorescence. Nature. 1995;373:663–664. doi:10.1038/373663b0