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上海碧云天生物技术股份有限公司
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Western Blot 实验技术全攻略
人阅读 发布时间：2020-07-29 15:16
Western Blot 实验技术全攻略
Western Blot 又称为蛋白质印迹，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的基于抗原抗体之间特异免疫反应的一种定量或定性检测蛋白的实验方法。
其基本原理为：SDS-PAGE 凝胶电泳将不同分子量的蛋白质样品分离，分离后的蛋白被转移到固相支撑物（杂交膜）上，一抗特异性识别目标蛋白，通过 HRP、AP、生物素、或者荧光探针等标记的二抗识别一抗，最终通过显色、荧光或者化学发光等方法将目标蛋白可视化，从而对目标蛋白进行定性和定量分析。
品对 Western Blot 实验至关重要。下面我们将从蛋白样品制备的方法和试剂选择上给大家一些建议。
详细了解目的蛋白及裂解液选择，请点击：https://www.biomart.cn/66245/news/2927209.htm
蛋白样品制备操作及浓度测定，请点击：https://www.biomart.cn/66245/news/2927228.htm
蛋白电泳
样品制备完成后，需要通过电泳将不同分子量大小的蛋白有效分开，以便能够检测目的蛋白的表达水平。
Western Blot 检测时，相对广泛采用的是 SDS-PAGE。对于 SDS-PAGE，是在电泳体系中加入变性剂 SDS 和还原剂 DTT 或者巯基乙醇等。蛋白质分子的多聚体或者高级结构会被打开，蛋白质氨基酸侧链和 SDS 结合形成蛋白-SDS 复合物，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量，因此可以有效消除不同蛋白质分子间的电荷差异和空间结构差异。所以 SDS-PAGE 检测时，可以利用分子筛效应将蛋白质依据分子量大小分离开来。
SDS-PAGE 一般采用不连续缓冲系统，即由分离胶和浓缩胶构成，这样对蛋白质的分离除了分子筛效应外，还有堆积效应，将较稀的蛋白样品经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。不连续缓冲系统的分离胶可以是均一胶，也可以是梯度胶。
详细了解请点击：https://www.biomart.cn/66245/news/2927237.htm
转膜
转膜，顾名思义，是将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体上，同时维持其相对位置和分辨率的过程。
转膜方式主要有两种：湿转和半干转。两者原理相同，只是用于固定胶/膜叠层及施加电场的仪器有不同。半干转耗时短，但是更适合小分子蛋白的转印，而湿转蛋白分子量范围较宽，两者的比较见表
1，在 Western Blot 实验中，常用的是湿转。
表 1.两种转膜方式的比较：
湿式转印系统示意图 半干转印系统示意图
详细了解，请点击：https://www.biomart.cn/66245/news/2927277.htm
免疫反应与检测
详细了解，请点击：https://www.biomart.cn/66245/news/2927350.htm
膜重复利用
在 Western 中完成了一抗二抗结合和后续的化学发光检测后，有时还需要检测 tubulin、actin 等内参蛋白，或检测其它蛋白进行比较。碧云天研发生产的 Western 一抗二抗去除液(P0025/P0025B/P0025N/P0025S)，用于 Western 中转移了蛋白的膜的重复利用。通过使用一抗二抗去除液，充分去除一抗二抗，可以非常方便地重新利用使用过的膜检测其它蛋白。和重新跑一个 SDS-PAGE 胶相比，不仅省时省力，而且可以消除重新上样而带来的误差，使可比性更强。
Western Blot 又称为蛋白质印迹，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的基于抗原抗体之间特异免疫反应的一种定量或定性检测蛋白的实验方法。
其基本原理为：SDS-PAGE 凝胶电泳将不同分子量的蛋白质样品分离，分离后的蛋白被转移到固相支撑物（杂交膜）上，一抗特异性识别目标蛋白，通过 HRP、AP、生物素、或者荧光探针等标记的二抗识别一抗，最终通过显色、荧光或者化学发光等方法将目标蛋白可视化，从而对目标蛋白进行定性和定量分析。
品对 Western Blot 实验至关重要。下面我们将从蛋白样品制备的方法和试剂选择上给大家一些建议。
详细了解目的蛋白及裂解液选择，请点击：https://www.biomart.cn/66245/news/2927209.htm
蛋白样品制备操作及浓度测定，请点击：https://www.biomart.cn/66245/news/2927228.htm
蛋白电泳
样品制备完成后，需要通过电泳将不同分子量大小的蛋白有效分开，以便能够检测目的蛋白的表达水平。
Western Blot 检测时，相对广泛采用的是 SDS-PAGE。对于 SDS-PAGE，是在电泳体系中加入变性剂 SDS 和还原剂 DTT 或者巯基乙醇等。蛋白质分子的多聚体或者高级结构会被打开，蛋白质氨基酸侧链和 SDS 结合形成蛋白-SDS 复合物，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量，因此可以有效消除不同蛋白质分子间的电荷差异和空间结构差异。所以 SDS-PAGE 检测时，可以利用分子筛效应将蛋白质依据分子量大小分离开来。
SDS-PAGE 一般采用不连续缓冲系统，即由分离胶和浓缩胶构成，这样对蛋白质的分离除了分子筛效应外，还有堆积效应，将较稀的蛋白样品经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。不连续缓冲系统的分离胶可以是均一胶，也可以是梯度胶。
详细了解请点击：https://www.biomart.cn/66245/news/2927237.htm
转膜
转膜，顾名思义，是将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体上，同时维持其相对位置和分辨率的过程。
转膜方式主要有两种：湿转和半干转。两者原理相同，只是用于固定胶/膜叠层及施加电场的仪器有不同。半干转耗时短，但是更适合小分子蛋白的转印，而湿转蛋白分子量范围较宽，两者的比较见表
1，在 Western Blot 实验中，常用的是湿转。
表 1.两种转膜方式的比较：
| 湿式转印系统 | 半干转印系统 |
| 小分子、大分子蛋白均可轻松转移 | 比较适合转移小分子蛋白（<120kD） |
| 转膜时间一般较长 | 转膜时间一般较短 |
湿式转印系统示意图 半干转印系统示意图
详细了解，请点击：https://www.biomart.cn/66245/news/2927277.htm
免疫反应与检测
详细了解，请点击：https://www.biomart.cn/66245/news/2927350.htm
膜重复利用
在 Western 中完成了一抗二抗结合和后续的化学发光检测后，有时还需要检测 tubulin、actin 等内参蛋白，或检测其它蛋白进行比较。碧云天研发生产的 Western 一抗二抗去除液(P0025/P0025B/P0025N/P0025S)，用于 Western 中转移了蛋白的膜的重复利用。通过使用一抗二抗去除液，充分去除一抗二抗，可以非常方便地重新利用使用过的膜检测其它蛋白。和重新跑一个 SDS-PAGE 胶相比，不仅省时省力，而且可以消除重新上样而带来的误差，使可比性更强。
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 |
| P0025N | Western一抗二抗去除液(中性) | 250ml |
| P0025B | Western一抗二抗去除液(弱碱性) | 250ml |
| P0025 | Western一抗二抗去除液(强碱性) | 250ml |
| P0025S | Western一抗二抗去除液(酸性) | 250ml |
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