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干货贴—非模式物种测序全攻略

人阅读 发布时间:2019-11-06 17:41

众所周知,细菌的同种菌不同菌株之间,基因组差异可达 5~20%,其变异部分与其致病性、抗生素耐药性十分相关。这种较大的差异使得基因组、转录组、蛋白质组的研究十分困难,再加上微生物复杂群落和共生体系使得研究更加困难!

虽然微生物的研究很复杂,但这并没有阻挡热血的科研工作者的步伐!看看常规的套路是什么?如果没有可靠的参考序列,一般采取两种策略:从头拼接或近缘物种 mapping。然而这两种策略,都各有其优缺点。从头拼接存在费时费力费钱、组装效果往往达不到预期、组装错误率高、注释困难等特点。近缘物种 mapping 对传统算法容错性低,序列差异度 <1.5% 的尚能应付,但同种菌不同菌株之间的差异就高达 5~20%。不同数据集波动极大,而且非常慢,消耗极大的计算资源。

每条路都很艰辛啊,好像没有策略的样子……肿么办?替做微生物研究的人儿感到心塞~~


BUT,生命不息,奋斗不止!这怎么可能难倒攀登高峰的科学家!分析神器出现!FANSe2 算法左扛“高精度”(mapping 错误率低至 10-3~10-6,满足一定的条件下,FANSe2 可保证 100% 的准确率), 右举“高容错”(容错率可高达 12%)。这对矛盾的小妖儿被它一举纳入囊中,有没有很厉害?!基于其突出优势,FANSe2 被定为人类蛋白质组计划核心支柱翻译组测序分析唯一算法。
 


FANSe2 mapping 错误率低至 10-3~10-6,全球首款可预估错误率的 mapping 算法,精度有理论保证
 


FANSe 容错能力可达 12%,因此 FANSe2 可为微生物研究提供坚实基础,采用 FANSe2 破解非模式物种测序难题!
 

策略: 有近缘基因组:基因组修正。没有近缘基因组:拼接—高容错 mapping

啧啧, 是不是勾起了内心的小疑问,说的很厉害,到底怎么样呢?通过下面的两个案例,先来看讲解实力(例)验证吧。
 

案例一、非模式菌株的基因组修正与蛋白质组鉴定(Wu et al., J Proteome Res, 2014)

研究背景:临床分离得到一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus ),进行了蛋白质谱分析。该菌没有参考序列,如何提高其蛋白鉴定效率?

研究方法:对该菌做 DNA 测序,以近缘物种(B. pumilus SAFR-032)参考基因组做修正,用修正后的序列做参考,提高了蛋白鉴定的效率。
 


 

承启的方法进行 7 轮修正,mapping 率迅速提高,稳定在 73.2%,共修正 182620 个 SNV,基因组差异大约 5%。

传统方法(Bowtie2+Samtools)只修正了 169 个 SNV 便无法继续修正了。
 

用传统Sanger毛细管电泳法验证:灰色碱基为不符合实际测序结果。
 

Bowtie2 和 Stampy 都无法修正或进行了错误的修正,而 FANSe 则完美地鉴定了 SNV,修正的基因组 100% 符合测序验证结果。
 



 

案例二、临床分离沙门氏菌的 RNA 测序验证

研究背景:某客户做 RNA 测序后,采用传统分析(CLCRNA denovo拼接)后发现结果不可靠,后来改用基因组修正的方案分析。即,以 RNA 测序的数据应用 FANSe2 对基因组修正,然后根据修正的基因组进行 RNA 定量差异分析,分析结果得到实验验证。
 



 

研究方法: 采用 CLC 转录组从头拼接,传统算法 Bowtie2 进行定量,发现差异表达基因分布明显异常。利用 FANSe2 基因组修正,FANSe2 基因表达定量 ,结果显示差异表达基因分布正常。
 


 

如下是两种方法的计算结果与实验验证结果对比:

左图:CLC 转录组从头拼接,传统算法 Bowtie2 进行定量

右图:FANSe2 基因组修正,FANSe2 基因表达定量
 

RT-PCR 实验验证结果:

FANSe2 结果与实验一致,传统方法与实验完全相反
 

再随机选取 5 个基因做 RT-PCR 验证,FANSe2 的结果全部得到验证!
 


 

定制化的分析策略,高精度的算法,详实的结果数据,这些都值得拥有!手上有样品的,没样品有想法的,多学科专家团队为您答疑解惑!欢迎前来承启生物咨询!

 

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