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转录组做的不过瘾?带你走进翻译组的神奇世界

人阅读 发布时间:2019-10-17 17:30

随着高通量测序技术的发展,转录组测序已走入科研 “寻常百姓家”,每个实验室大概都有师兄师姐曾测过十个八个的转录组吧。但是,看遍了千篇一律的差异基因聚类图,是不是想换点新花样?面对竞争日益增大的科研压力,是否应该为课题研究寻找新的方向和切入点?承启生物给各位看官呈上一份翻译组学的攻略,各位不妨来了解了解翻译调控这一 “调控之王”。

如果您恰好从事的是与蛋白相关的研究,并且恰好存在以下几点疑问及需求,就更应该尝试翻译组学测序。

  • 想做差异蛋白质组学,但鉴定效果差或无参考基因组。

  • 想看某基因造成的全局性功能影响,指导后续实验。

  • 已知表型差异,想找出与之相关的基因 / 蛋白质。

  • RNA 与蛋白质变化不一致,想找到原因。


下面小编将着重为你讲解翻译组,带您走进翻译组的神奇世界,打开翻译调控的大门。

1、翻译组是什么?

翻译组包括广义的翻译组和狭义的翻译组,广义的翻译组指的是直接参与翻译过程的所有元件,包括核糖体、正在翻译的 mRNA、tRNA、调控性 RNA (如 miRNA,lncRNA 等)、新生肽链 (nascentpolypeptide chain )、各种翻译因子等;狭义的翻译组特指正在翻译的 mRNA。 



 

2、转录组与翻译组的区别是什么?

转录组测序,是对组织或细胞中所有的 mRNA 进行测序,无论有没有在翻译;可比较不同组织、细胞之间的转录组层面的表达量变化。另外,转录组测序无法知晓以往认为不编码蛋白质的 RNA 是否能被翻译,亦即无法发现新蛋白。如果用转录组的数据去指导未知蛋白的发现,,会造成假阳性和假阴性。

mRNA 是蛋白质合成的信息蓝图,研究正在翻译的 mRNA 就是翻译组研究的首要任务。获得正在翻译的 mRNA 方法主要包括多聚核糖体分析技术 (polysome profiling)、核糖体足迹谱技术 (ribosome profiling)、核糖体亲和纯化技术 (translating ribosome affinitypurification,TRAP)、和翻译谱分析技术 (translatomeprofiling)。

 


 

在此部分,我们主要对翻译中 mRNA (即 RNC-mRNA) 进行详细阐述。RNC-mRNA 直接分离技术使用 30% 的单一浓度蔗糖溶液作为缓冲液,通过超速冷冻离心将核糖体组分与游离 mRNA 以及其他细胞组份分离开来。由于所有的核糖体组分全部被压在管底的沉淀中,弃去上清并保留沉淀抽提 RNA,即可得到 RNC-RNA。利用高通量测序技术等对获得的 RNC-mRNA 进行分析,即可得到特定翻译状态下所有正在翻译的全长 mRNA 信息,这种测序方法又被称为 RNC-seq,通过分析可得 RNC-mRNA 的丰度与类型。

3、为什么要做翻译组学研究,翻译组能解决什么问题?
2011 年 Schwanhausser 等 [1] 人在《Nature》杂志上发表文章,通过理论计算及实验手段发现,翻译调控对生命体的影响占了 54% 比例,比其他阶段(mRNA 生成、mRNA 降解和蛋白质降解)的调控影响总和还要大,是当之无愧的调控之王,是生命调控的绝对主要环节。因此,从整体上研究翻译调控是极其必要的。

那么翻译组能帮助科研工作者解决什么问题呢?

首先,在技术层面上:

(1)可间接鉴定蛋白质,比质谱精度高多了,且不受蛋白质理化性质的限制。而且序列覆盖度超高,对各种变异的检测效果大大高于质谱。

Zhong 等 [2] 提出可以用翻译组分析技术辅助蛋白质组鉴定,用以找到已知和未知编码基因的翻译证据。翻译组测序不依赖原有基因的注释即可给出细胞内蛋白质确定性的翻译证据;不存在抗体 “低染” 不确定性的问题,因此可以很有效地检测细胞 / 组织特异性表达蛋白,还可以在 RNC-mRNA 中发现一些以往被误认为是非编码 RNA 的基因。例如在肺癌细胞中,应用 RNC-seq 发现了 1397 个 RefSeq 数据库中被标注为非编码 RNA 的基因,而该数据表明这些标注为非编码的基因很有可能被翻译为蛋白质,因此人类基因组可能需要进行系统性的重新注释 [3]。以上证据表明翻译组测序方法不但可以作为蛋白质组学的重要补充,还可以独立地作为发现新蛋白质的一种有效手段。

(2)提高蛋白质组搜库的效果。

(3)为非模式生物的蛋白质组提供准确参考库。


其次,在功能层面上:

(1)TR---- 功能 / 表型,取代差异蛋白质组技术。

通过平行测定同一组样品的 mRNA 和 RNC-mRNA,即可计算出每个基因的翻译比率 (Translation ratio, TR) 值。在真核生物中,由于翻译起始是蛋白质合成主要限速步骤,因此 TR 值可以近似代表翻译起始效率。Wang [4] 等利用翻译组测序技术对肺癌细胞和正常细胞进行分析,发现肺癌细胞中全局性 mRNA 的翻译起始效率 (以 TR 表征) 普遍比正常细胞上调,其中 TR 上调幅度最大的 123 个基因几乎完整体现了癌细胞的各种表型,精准程度远胜 SILAC 定量蛋白质组,说明优先翻译的基因决定着细胞的功能与表型。

(2)EVI(翻译延伸速率)---- 折叠质量。

在癌细胞翻译延伸的整体调控方面,Lian 等 [5] 测定了生理条件下每个基因的翻译起始效率,发现癌细胞中促癌基因的翻译速率显著降低,而下调翻译速率能有效保证这些基因蛋白的正确折叠,从而使这些促癌基因正常行使功能;与此同时,已知的抑癌基因在癌细胞中的翻译速率被主动上调,使其难以正确折叠成有功能的蛋白质,从而不能发挥抑癌作用。这一正一反的翻译延伸调控,使得癌细胞主动、选择性地维持了其恶性表型。

4、想做翻译组,该怎么送样呢?

RNC-seq 的技术难点在于 RNC-mRNA 复合体的分离,因为 RNC-mRNA 复合体极为脆弱,非常容易在处理过程中造成核糖体解离或 mRNA 断裂,处理不当极易得不到全长 RNC-mRNA,造成 RNC-mRNA 定量失准。而且对环境洁净度及操作精确度都要求极高。但这些研究工作者统统不用担心,深圳承启生物科技有限公司可完成一整套的 RNC 分离及 mRNA 提取。您只需要在采集样本前,与承启生物联系,公司将会给您提供 RNC-mRNA 测序样本准备指南及专用样本保存液。实验保障妥妥的,为您解除实验操作后顾之忧。

如有送样或者实验相关的疑问,可与承启生物的技术人员沟通联系,将由专家团队为您提供整体方案设计,为您的科研助力。

 

参考文献:

[1] Schwanhausser, B., Busse, D., Li, N., Dittmar, G., et al.,Corrigendum: Global quantification of mammalian gene expression control. Nature2013, 495, 126-127.

[2]Yang XY, He K, Du G, et al. Integrated Translatomics with Proteomics toIdentify Novel Iron-Transporting Proteins in Streptococcus pneumoniae. Front Microbiol, 2016, 7: 78.
[3] Zhong J, Cui Y, Guo J, et al. Resolving chromosome-centric human proteomewith translating mRNA analysis: a strategic demonstration. J Proteome Res,2014, 13(1):50-59.

[4]Wang T, Cui Y, Jin J, et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteinsin a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific.Nucleic Acids Res, 2013, 41(9): 4743-4754.

[5]Lian X, Guo J, Gu W, et al. Genome-Wide and Experimental Resolution of RelativeTranslation Elongation Speed at Individual Gene Level in Human Cells. PLoS Genet,2016, 12(2): e1005901.

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