pull-down检测实验流程

pull-down检测实验流程

pull-down检测实验外包：15701002394

一、实验准备

1、材料与试剂

1) 细胞或组织样本

2) 诱饵蛋白（可通过原核表达系统表达并纯化获得，或购买商业化的重组蛋白）

3) 特异性抗体（针对诱饵蛋白，用于后续验证）

4) 磁珠（如Protein A/G磁珠，能与抗体特异性结合）

5) 裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂，如PMSF）

6) 洗涤缓冲液（如PBS-Tween 20）

7) 洗脱缓冲液（如甘氨酸-HCl，pH 2.5-3.0）

8) SDS-PAGE相关试剂（丙烯酰胺、Tris-HCl、SDS、过硫酸铵、TEMED等）

9) Western blot相关试剂（转膜缓冲液、封闭液、二抗等）

2、仪器设备

离心机、超声破碎仪、磁力架、恒温摇床、电泳仪、转膜仪、化学发光成像系统

二、实验步骤

1、样本处理

1) 收集适量细胞或组织样本，用预冷的PBS洗涤2-3次，去除杂质。

2) 加入适量裂解缓冲液，冰上裂解30分钟，期间可间断振荡。

3) 超声破碎细胞，设置合适功率和时间（如功率200W，超声3秒，间隔5秒，共30次），使细胞充分裂解。

4) 4℃，12000g离心15分钟，取上清转移至新的离心管，弃沉淀。

2、诱饵蛋白与磁珠结合

1) 取适量磁珠，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次在磁力架上分离磁珠和上清，弃上清。加入适量诱饵蛋白溶液，与磁珠充分混合，4℃恒温摇床孵育1-2小时，使诱饵蛋白与磁珠结合。

2) 孵育结束后，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附在管壁，弃上清。

3) 用洗涤缓冲液洗涤磁珠-诱饵蛋白复合物3次，每次洗涤后在磁力架上弃上清。

3、孵育与捕获互作蛋白

1) 将上述洗涤后的磁珠-诱饵蛋白复合物加入到细胞或组织裂解上清中，4℃恒温摇床孵育过夜，使诱饵蛋白与互作蛋白充分结合。

2) 孵育结束后，将离心管置于磁力架上，弃上清。

3) 用洗涤缓冲液洗涤磁珠-诱饵蛋白-互作蛋白复合物5-6次，每次洗涤后在磁力架上弃上清，以充分去除非特异性结合蛋白。

4) 洗脱互作蛋白

5) 向磁珠-诱饵蛋白-互作蛋白复合物中加入适量洗脱缓冲液，轻轻吹打混匀，室温孵育5-10分钟。

6) 将离心管置于磁力架上，收集上清，上清中即为洗脱下来的互作蛋白。

三、分析鉴定

1、通过SDS-PAGE对洗脱下来的互作蛋白进行分离，根据蛋白分子量大小不同在凝胶上呈现不同条带。

2、将SDS-PAGE凝胶上的蛋白转移至PVDF膜或NC膜上，进行Western blot分析。

3、用针对诱饵蛋白的特异性抗体进行孵育，再用相应的二抗孵育，通过成像系统检测条带，验证互作蛋白与诱饵蛋白的结合情况。