ECL发光液的使用方法

ECL发光液（Enhanced Chemiluminescence，增强型化学发光）是Western Blot实验中常用的蛋白检测手段，其核心原理是在辣根过氧化物酶（HRP）催化下，鲁米诺（Luminol）与过氧化氢（H₂O₂）发生氧化反应，生成激发态中间体并释放光子（波长约425 nm），从而产生可被X光胶片或成像系统捕获的荧光信号。

以下是标准且高效的ECL发光液使用方法：

一、工作液配制

‌现配现用‌：大多数ECL发光液由A液（发光底物）和B液（增强剂/过氧化物）组成，需在使用前等体积混合（如1:1）。

‌避光操作‌：混合过程应避光进行，防止试剂提前降解。

‌即用型产品‌：部分新型超敏发光液为即用型，无需预混，可直接滴加，减少污染风险。

二、膜处理与孵育

完成转膜、封闭、一抗与二抗孵育后，用PBST或TBST充分洗涤3次，每次5–10分钟。

用平头镊取出膜，滤纸轻吸去多余液体（勿接触蛋白面）。

将膜蛋白面朝上置于洁净保鲜膜或塑料容器中。

三、发光反应

根据膜面积滴加ECL工作液（推荐用量：‌0.1–0.125 mL/cm²‌），确保完全覆盖。

室温孵育1–3分钟（超敏试剂可缩短至10–15秒），避免过长时间导致背景升高。

轻轻沥干多余液体，勿水洗。

四、信号检测

‌压片检测‌：

将膜夹于两层保鲜膜之间，赶尽气泡。

放入暗盒，蛋白面朝上，覆盖X光胶片。

曝光时间从数秒至数小时不等，弱信号可延长至10小时。

‌化学发光成像仪检测‌：

直接将膜放入成像仪，按设备说明采集图像。

可实时调整曝光时间，避免过曝或信号不足。