蛋白免疫印迹的基本原理及操作步骤

基本原理：
免疫印迹（Western Blot） 采用的是聚丙/烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。SDS-PAGE 可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的 NC 膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如 5%BSA 或脱脂奶粉溶液）处理，封闭 NC 膜上的疏水结合位点。用目标蛋白的抗体（一抗）处理 NC 膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过的 NC 膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG 的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。

优点：
免疫印迹法是一项分析抗原、抗体的技术。
1.湿的固定化基质膜柔韧, 易于操作；
2.固定化的生物大分子可均一的与各种免疫探针接近, 不会象凝胶那样受孔径阻隔；
3.免疫印迹分析只需少量试剂；
4.孵育、洗涤的时间明显减短；
5.可同时制作多个拷贝, 用于多种分析和鉴定；
6.结果以图谱形式可长期保存；
7.免疫探针可通过降低PH值等方法, 象抹去录音磁带一样将探针抹掉, 再换用第二探针进行分析检测。免疫印迹法的应用范围及优点不仅局限于此, 它必将随着这一方法的深入研究而不断发展和完善。

操作步骤：

1.组织或细胞裂解：将需要检测的细胞或组织样本进行裂解，以释放蛋白质。常用的裂解缓冲液包括RIPA缓冲液和NP-40缓冲液等。

2.蛋白质浓度测定：使用蛋白质浓度测定方法（如BCA或Bradford法）确定样品中的总蛋白质浓度。

3.蛋白质电泳：将样品中的蛋白质根据大小通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离。在电泳过程中，样品通常会与还原剂（如β-巯基乙醇）和离子变性剂（如SDS）混合，以使蛋白质变性并带有负电荷。

4.转膜：将分离的蛋白质从凝胶转移到聚合物膜（通常是聚偏氟乙/烯膜或硝酸纤维素膜）上。这通常通过电泳转印（electroblotting）完成，其中将膜与凝胶层叠放置，并应用电流使蛋白质迁移至膜上。

5.阻断：将膜放入含有蛋白质阻断剂（如牛血清蛋白、脱脂奶粉或鱼胶）的缓冲液中，以阻止非特异性结合。

6.一抗孵育：将膜与目标蛋白质特异性的一抗（抗体）溶液孵育，使一抗与目标蛋白质发生特异性结合。

7.洗涤：用缓冲液反复洗涤膜，以去除非特异性结合的一抗。

8.二抗孵育：将膜与与一抗的宿主物种不同、带有酶标记的二抗孵育。二抗将特异性地与一抗结合。

9.再次洗涤：用缓冲液反复洗涤膜，以去除非特异性结合的二抗。

10.信号检测：添加特定底物（如光敏底物或发光底物），使酶标记的二抗产生可观察的信号。该信号通常是光辐射或发光。

11.成像和分析：使用化学发光设备（如X光片或光学成像系统）记录膜上的信号，并进行定量分析。

PS：在每一步中因采用的具体实验方法不同, 可构成多种免疫印迹分析系统。