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浙江联硕生物科技有限公司
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浙江联硕生物科技有限公司
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公司新闻/正文
PCR实验中一听到就令人 犯愁的PCR异常曲线
922 人阅读发布时间：2020-12-14 14:37
在PCR实验过程中，我们经常会遇到各种奇特的扩增曲线，如何正确解读这些曲线并且做出恰当的解决方案是我们一线实验者需要练就的基本功。今儿，将多年累积的功力编成“武功秘籍”奉上，助你PK掉那些令人犯晕的异常曲线。
异常曲线1：PCR扩增抑制
原因分析：H07存在扩增抑制
解决方案：将样本稀释后进行扩增（抑制物的影响可通过稀释样本消除
异常曲线2：自动基线设置问题
原因分析：自动基线问题
解决方案：手动设置基线。将Baseline End设置为“扩增信号出现的前一个循环”即，图片展原始为26，将其设置为20，点击OK即可恢复正常曲线。
异常曲线3：荧光定量PCR实验结果中无Ct值出现
原因分析：
（1）PCR参数设置错误：在设计循环参数时没有设置荧光信号采集；
（2）模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况；
（3）引物或者探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；
（4）电脑设置了自动休眠。
解决方案：按照原因分析进行一一核查，对症处理。
异常曲线4：斜直线型扩增曲线
PCR实验首次检测呈斜直线型扩增曲线，再次复检后结果基本均为正常阴性。
原因分析：
分液不准确，检查检测后的反应管可发现管内的PCR反应液量明显少于正常管；反应管气密性差，反应过程中溶液蒸发引起探针浓度增加，导致曲线呈斜直线状。
解决方案：分液均匀，上机前检查八连管液面是否在同一水平线上；八连管盖盖严，上机前检查是否有缝隙。
异常曲线5：扩增曲线末尾起跳
PCR实验结果中有曲线出现末尾起跳但是没有完整扩增的现象。
原因分析：
（1）阴参曲线末尾起跳，通常表示存在污染；
（2）复检样本，排除非特异性扩增的可能性；
（3）正常样本也可存在曲线末尾起跳，表示样本浓度低或者加样量不准确。
解决方案：排除是否存在污染；排除污染原因后复检样本，如果复检后曲线为阴性直线则说明之前的末尾起跳为非特异性扩增，如果复检后曲线仍与之前一致则说明末尾起跳表示该样本中待检病毒核酸的浓度偏低。
异常曲线6：山域型曲线
原因分析：严重的蒸发会呈现先上升后下降的曲线，轻微的蒸发会是一种缓慢的上升，这两类异常的曲线可以看一下检测后的反应管液面是否有下降的现象来证明。
解决方案：上机检测前检查八连管管盖，保证无缝隙后上机扩增。
异常曲线7：扩增曲线有向上或者向下的尖峰
原因分析：
（1）仪器不稳定导致的扩增曲线异常（也可能突然停电或者电压不稳）；
（2）如果尖峰向下，可能是卤素灯老化所致发射光源不稳定（指卤钨灯光源的激发器）
（3）如果是单一的孔位出现尖峰，除了考虑仪器或者孔位问题外，还要考虑反应体系是否有气泡所致。
解决方案：按照原因分析进行一一核查，对症处理。
背景知识
判断扩增曲线是否良好的指标
1.曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显，扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。
2.曲线指数期斜率与扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高。
3.标准的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势。
4.各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效率相近。
异常曲线1：PCR扩增抑制
原因分析：H07存在扩增抑制
解决方案：将样本稀释后进行扩增（抑制物的影响可通过稀释样本消除
异常曲线2：自动基线设置问题
原因分析：自动基线问题
解决方案：手动设置基线。将Baseline End设置为“扩增信号出现的前一个循环”即，图片展原始为26，将其设置为20，点击OK即可恢复正常曲线。
异常曲线3：荧光定量PCR实验结果中无Ct值出现
原因分析：
（1）PCR参数设置错误：在设计循环参数时没有设置荧光信号采集；
（2）模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况；
（3）引物或者探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；
（4）电脑设置了自动休眠。
解决方案：按照原因分析进行一一核查，对症处理。
异常曲线4：斜直线型扩增曲线
PCR实验首次检测呈斜直线型扩增曲线，再次复检后结果基本均为正常阴性。
原因分析：
分液不准确，检查检测后的反应管可发现管内的PCR反应液量明显少于正常管；反应管气密性差，反应过程中溶液蒸发引起探针浓度增加，导致曲线呈斜直线状。
解决方案：分液均匀，上机前检查八连管液面是否在同一水平线上；八连管盖盖严，上机前检查是否有缝隙。
异常曲线5：扩增曲线末尾起跳
PCR实验结果中有曲线出现末尾起跳但是没有完整扩增的现象。
原因分析：
（1）阴参曲线末尾起跳，通常表示存在污染；
（2）复检样本，排除非特异性扩增的可能性；
（3）正常样本也可存在曲线末尾起跳，表示样本浓度低或者加样量不准确。
解决方案：排除是否存在污染；排除污染原因后复检样本，如果复检后曲线为阴性直线则说明之前的末尾起跳为非特异性扩增，如果复检后曲线仍与之前一致则说明末尾起跳表示该样本中待检病毒核酸的浓度偏低。
异常曲线6：山域型曲线
原因分析：严重的蒸发会呈现先上升后下降的曲线，轻微的蒸发会是一种缓慢的上升，这两类异常的曲线可以看一下检测后的反应管液面是否有下降的现象来证明。
解决方案：上机检测前检查八连管管盖，保证无缝隙后上机扩增。
异常曲线7：扩增曲线有向上或者向下的尖峰
原因分析：
（1）仪器不稳定导致的扩增曲线异常（也可能突然停电或者电压不稳）；
（2）如果尖峰向下，可能是卤素灯老化所致发射光源不稳定（指卤钨灯光源的激发器）
（3）如果是单一的孔位出现尖峰，除了考虑仪器或者孔位问题外，还要考虑反应体系是否有气泡所致。
解决方案：按照原因分析进行一一核查，对症处理。
背景知识
判断扩增曲线是否良好的指标
1.曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显，扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。
2.曲线指数期斜率与扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高。
3.标准的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势。
4.各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效率相近。