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浙江联硕生物科技有限公司
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浙江联硕生物科技有限公司
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公司新闻/正文
涨姿势啦！感受态细胞转化效率高，原来都这样做啊！
11967 人阅读发布时间：2019-07-15 10:14
从事多年的研发实验，平时常常听到客户这样问，为什么我也是用的这个感受态细胞，但转化效率没那么高？今天浙江联硕生物科研者为大家进行详细讲解，教你如何提高感受态细胞转化率。
感受态转化效率定义
转化效率定义为转化 1 μl 质粒至给定体积的感受态细胞中所能产生的菌落形成单位（cfu）的数量。但是，转化 1 μl 质粒是不常见的。
实际上，转化效率常以在适条件下转化 100 pg～1 ng 高纯度超螺旋质粒来计算。
计算转化效率（TE）的公式为：TE=菌落数/μg/稀释度。
转化效率计算可以用来做比较细胞或连接效率。下面列出了推荐转化方法和一些技巧以帮助获得实验结果。
推荐方案
一、转化方法
冰上解冻细胞；
细胞中加入 10 ng～100 ng 的质粒 DNA（1-5 μl），混匀，切忌涡旋；
置于冰上 30 分钟；
42 热激 60 秒或根据推荐条件进行热激；
置于冰上 5 分钟；
加入 900 μl 室温的 SOC；
37 震荡（250 rpm）培养 60 分钟；
混匀细胞，切忌涡旋，并用 SOC 做 10 倍梯度稀释；
每个稀释比例取 50～100 μl 稀释液涂布于预热的选择平板上，37（SHuffle 菌株 30）过夜培养或按推荐条件培养 。
二、5 分钟转化方法
（与上述方法相比只有 10% 的转化效率）
手握解冻细胞；
细胞加入 10 ng～100 ng 的质粒 DNA（1-5 μl），混匀，切忌涡旋；
置于冰上 2 分钟；
42 热激 30 秒或按推荐方案进行热激；
置于冰上 2 分钟；
加入 900 μl 室温的 SOC 或 LB。快速取 50～100 μl 涂布于选择平板上，37 过夜培养（SHuffle 菌株 30）。
注意：使用非氨苄青霉素时，需要 37 震荡培养
转化技巧
01、解冻
细胞在冰上解冻；
管中的后一点感受态融化后，立即加入 DNA；
可以手握解冻细胞，但是一旦温度高于 0 时，转化效率就会下降；
细胞与 DNA 冰浴；
冰浴 30 分钟。预计每缩短 10 分钟会降低转化效率2倍 。
02、热激
温度和时间取决于转化体积和适用的容器，一般为 42 孵育 60 秒。
03、生长
37 生长1 小时对于细胞恢复和抗生素抗药性表达具有效果。预计每缩短 15 分钟会有 2 倍的转化效率损失；
SOC 比 LB 培养基的转化效率高 2 倍；
震荡或旋转晃动试管可使转化效率提高 2 倍 。
04、涂平板
选择转化效率不受温度、湿度明显影响的平板；
温暖而干燥的平板利于涂布，并能快速长出菌落。
05、DNA
用于转化的 DNA 应纯化，并重悬于水中或TE缓冲液中；
直接从连接产物中取 10 μl 的 DNA 用于转化，仅有 2 倍效率损失；
为实现转化，可通过柱离心或酚抽提和乙醇沉淀的方法纯化 DNA；
适 DNA 用量比通常认为的要低，纯化超螺旋 pUC19 的用量在 100 pg～1 ng 之间时转化效率高。但是，随着 DNA 用量增加至 100 ng，单次转化反应中得到的总克隆数也会增多。
感受态转化效率定义
转化效率定义为转化 1 μl 质粒至给定体积的感受态细胞中所能产生的菌落形成单位（cfu）的数量。但是，转化 1 μl 质粒是不常见的。
实际上，转化效率常以在适条件下转化 100 pg～1 ng 高纯度超螺旋质粒来计算。
计算转化效率（TE）的公式为：TE=菌落数/μg/稀释度。
转化效率计算可以用来做比较细胞或连接效率。下面列出了推荐转化方法和一些技巧以帮助获得实验结果。
推荐方案
一、转化方法
冰上解冻细胞；
细胞中加入 10 ng～100 ng 的质粒 DNA（1-5 μl），混匀，切忌涡旋；
置于冰上 30 分钟；
42 热激 60 秒或根据推荐条件进行热激；
置于冰上 5 分钟；
加入 900 μl 室温的 SOC；
37 震荡（250 rpm）培养 60 分钟；
混匀细胞，切忌涡旋，并用 SOC 做 10 倍梯度稀释；
每个稀释比例取 50～100 μl 稀释液涂布于预热的选择平板上，37（SHuffle 菌株 30）过夜培养或按推荐条件培养 。
二、5 分钟转化方法
（与上述方法相比只有 10% 的转化效率）
手握解冻细胞；
细胞加入 10 ng～100 ng 的质粒 DNA（1-5 μl），混匀，切忌涡旋；
置于冰上 2 分钟；
42 热激 30 秒或按推荐方案进行热激；
置于冰上 2 分钟；
加入 900 μl 室温的 SOC 或 LB。快速取 50～100 μl 涂布于选择平板上，37 过夜培养（SHuffle 菌株 30）。
注意：使用非氨苄青霉素时，需要 37 震荡培养
转化技巧
01、解冻
细胞在冰上解冻；
管中的后一点感受态融化后，立即加入 DNA；
可以手握解冻细胞，但是一旦温度高于 0 时，转化效率就会下降；
细胞与 DNA 冰浴；
冰浴 30 分钟。预计每缩短 10 分钟会降低转化效率2倍 。
02、热激
温度和时间取决于转化体积和适用的容器，一般为 42 孵育 60 秒。
03、生长
37 生长1 小时对于细胞恢复和抗生素抗药性表达具有效果。预计每缩短 15 分钟会有 2 倍的转化效率损失；
SOC 比 LB 培养基的转化效率高 2 倍；
震荡或旋转晃动试管可使转化效率提高 2 倍 。
04、涂平板
选择转化效率不受温度、湿度明显影响的平板；
温暖而干燥的平板利于涂布，并能快速长出菌落。
05、DNA
用于转化的 DNA 应纯化，并重悬于水中或TE缓冲液中；
直接从连接产物中取 10 μl 的 DNA 用于转化，仅有 2 倍效率损失；
为实现转化，可通过柱离心或酚抽提和乙醇沉淀的方法纯化 DNA；
适 DNA 用量比通常认为的要低，纯化超螺旋 pUC19 的用量在 100 pg～1 ng 之间时转化效率高。但是，随着 DNA 用量增加至 100 ng，单次转化反应中得到的总克隆数也会增多。