sgRNA 的设计原则
发布时间:2019-11-20 10:45 | 点击次数:
向导RNA(guide RNA,gRNA),也称为小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)。是作用于动质体(kinetoplastid)体内一种称为RNA编辑(RNA editing)的后转录修饰过程中。也是一种小型非编码RNA。可与pre-mRNA配对,并在其中插入一些尿嘧啶(U),产生具有作用的mRNA。向导RNA编辑的RNA分子,长度大约是60~80个核苷酸,是由单独的基因转录的,具有3'寡聚U的尾巴,中间有一段与被编辑mRNA精确互补的序列,5'端是一个锚定序列,它同非编辑的mRNA序列互补。
1)sgRNA的长度:S. pyogenes II型CRISPR系统(SpCas 9)一般为20nt。
2)sgRNA序列的碱基组成:基因特异的sgRNA 模板序列为位于PAM 序列前,PAM序列的特征为NGG (N可以为任意核苷酸),所以选择3'末端含有GG的sgRNA,这样可以构成PAM序列。同时,sgRNA的序列应避免以4个以上的T结尾,GC%含量最佳为30%-70%(40%-60%)。
3)sgRNA的序列与On-target和Off-target的匹配数都应尽可能的高,一般大于60,认为是可用的。
4)如果构建U6启动子或T7启动子驱动sgRNA的表达载体,需要考虑sgRNA的5'碱基为G或GG,来提高其转录效率。
5)全基因的脱靶效应分析,需要考虑脱靶位点的错配碱基数,尽量不超过5个。
6)如果想要造成基因移码突变,需要尽量靠近基因编码区的ATG下游,尽量位于第一或第二外显子上。