原代细胞培养技术

一、组织块直接培养法

1、取材，用 Hank's 液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
2、用手术剪将组织剪切成 1 mm³ 左右的小块，再用 Hank's 液洗三次。
3、将组织块转移至培养瓶，并贴附于瓶底面。
4、轻轻将培养瓶翻转，瓶底朝上，向瓶内注入适量的培养液，将培养瓶放置在 37 ℃ 恒温箱内培养。
5、放置待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37 ℃ 继续培养。

二、消化培养法

1、取材，用 Hank's 液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
2、用手术剪将组织剪切成 1 mm³ 左右的小块，再用 Hank's 液洗三次。
3、视组织块量加入酶液，37 ℃ 中消化 20～40 分钟，每隔 5 分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
4、加入 3～5 mL 培养液以终止酶消化作用（或加入相关酶抑制剂）。
5、静置 5～10 分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
6、1,000 rpm，离心 10 分钟，弃上清液。
7、加入 Hank's 液 5 mL，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
8、加入培养液 1～2 mL（视细胞量），血球计数板计数。
9、将细胞转移到培养瓶中，37 ℃ 下培养。

三、 器官培养

1、将不锈网做成支架形状，调整其高度至培养皿的 1/2 深度平面，在其表面放置 0.5 μm 孔径滤膜。
2、将培养液加入培养皿中，使液面刚刚接触到滤膜，但不要使其浮起。
3、将要培养器官组织放在滤膜上，一般厚度不要超过 200 μm，水平面积不超过 10 mm²。
4、将上述准备好的培养物放入 CO₂ 培养箱，并加注氧气调整氧分压，最好到 90%。
5、培养过程中要注意观察培养液平面，尽可能保持在与滤膜一致的水平上。
6、上述可进行器官培养 1～3 周，每 2～3 天换液一次，并根据情况做进一步实验和检测。
 

原代细胞传代技术

一、贴壁细胞的消化法传代

1、吸除或倒掉瓶内旧培养液。
2、加入 1 mL 左右消化液（胰蛋白酶或与 EDTA 混合液）轻轻摇动培养瓶，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3、消化 2～5 分钟后把培养瓶放置在显微镜下进行观察，发现原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时，弃去消化液，加入培养液终止消化。
4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分别接种到另外两到三个培养瓶中，置 37 ℃ 培养箱中继续培养。第二天观察贴壁生长情况。

二、悬浮细胞的传代

1、直接传代
① 让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清吸掉 1/2～2/3。
② 用吸管吹打形成细胞悬液后，分别接种到另外两到三个培养瓶中，置 37 ℃ 培养箱中培养。

2、离心法传代
① 将细胞连同培养液一并转移到离心管内，离心 800-1,000 rpm，5 分钟。
② 去除上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打使之形成细胞悬液。
③ 将细胞悬液分别接种到另外两到三个培养瓶中，置 37 ℃ 培养箱中培养。

 

原代细胞冻存技术

1、选用生长情况好，数量较多的原代细胞，冻存前一天换液一次。
2、贴壁细胞需用 0.25% 胰酶常规消化将细胞消化下来，将细胞悬液收集至离心管中。
3、1,000 rpm 离心 5 分钟，弃上清液。
4、沉淀加含 DMSO 的培养液，计数，调整至（1-10）×10⁶/mL。
5、将悬液分至冻存管中，每管 1 mL。
6、密封冻存管，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
7、用记号笔标明细胞种类，冻存日期。
8、按下列顺序降温：室温→4 ℃（20 分钟〕→冰箱冷冻室（30 分钟）→超低温冰箱（-80 ℃ 过夜）→液氮。

 

原代细胞复苏技术

1、取出细胞，迅速放入 37 ℃ 温水中快速解冻。
2、吸出细胞悬液，并加 10 倍以上培养液。
3、1,000 r/分钟离心 5 分钟，去除上清。
4、用培养液适当稀释后接种培养瓶，放入 37 ℃ CO₂ 培养箱静置培养。
5、镜检细胞贴壁能力。次日更换一次培养液，继续培养。

 

原代细胞鉴定技术

一、形态学鉴定

1、在倒置显微镜中直接观察活细胞的形态学特征
2、细胞染色检查 ：
a) 将无菌玻片置于细胞培养皿中，加细胞悬液后培养；
b) 待细胞长满玻片后取出，用 PBS 清洗，之后放于载玻片上，待其自然干燥；
c) 用 PBS/甲醇（1:1）固定 15 分钟；
d) 弃固定液，加合适的染色液染色；
e) 染色完毕后用清水洗净，置于空气中干燥，
f) 干燥后，用二甲本透明，光学树脂封片后观察。

二、免疫组织细胞化学鉴定

1、将无菌的盖玻片置于细胞培养皿中，将细胞悬液接种于培养皿中进行细胞爬片；
2、PBS  清洗标本 3 次，各 1 分钟；
3、4% 多聚甲醛固定 15 分钟；
4、置于空气中干燥；
5、PBS 清洗标本 3 次，各 2 分钟；
6、0.5% Triton X-100  孵育 1 次 20 分钟；
7、PBS 清洗标本 3 次，各 2 分钟；
8、3% H₂O₂  孵育 15 分钟；
9、DPBS  清洗标本 3 次，各 2 分钟；
10、封闭血清孵育（5%  正常二抗血清 DPBS 液 20 分钟）
11、一抗孵育，4 ℃ 过夜或 37 ℃ 60 分钟；
12、PBS 清洗标本 3 次，各 5 分钟；
13、二抗工作液孵育（湿盒）37 ℃ 30 分钟；
14、PBS 清洗标本 3 次，各 5 分钟；
15、C 液（湿盒）37 ℃ 30 分钟；
16、PBS 清洗标本 3 次，各 5 分钟；
17、用显色液进行显色；
18、蒸馏水洗涤 2 次 1 分钟；
19、苏木素复染 1 分钟；
20、清水洗涤 30 分钟；
21、光学树脂封片后观察。
 

原代细胞分离技术

取人或动物体内（或胚胎）的组织，将其剪碎至 1 mm³ 的组织块，再采用的如下方法进行分离培养：
 

一、悬浮细胞的分离方法

1、将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中，1,000 rpm/分钟离心 5 分钟。
2、去掉上清，离心沉淀用无钙、镁的 PBS 清洗后  1,000 rpm/分钟离心 5 分钟。此步重复两次。
3、用培养基重悬，调整适当细胞浓度后分瓶培养。
4、如选用悬液中某种细胞，可采用离心后的细胞分层液收获目的细胞。

二、实体组织材料的分离方法
 

（一）机械分散法

1、纤维成分很少的脑组织，部分胚胎组织，用剪刀剪碎至 1 mm³ 的组织块。
2、用 PBS 清洗两次后
①用吸管吹打，分散组织细胞。
②或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出。
③或在不锈钢纱网内用钝物（注射器钝端）压挤使细胞从网孔中压挤出。
3、收集细胞转入离心管中，1,000 rpm/分钟离心 5 分钟。
4、去上清，加入含血清的培养基，重悬后移至培养瓶中培养。
 

（二）消化分离法

1、酶消化分离法（过夜冷消化法）
①细胞间质较少的软组织，如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等，用 Hanks 液清洗组织三次，剪成碎块大小为 4 毫米左右。
②再用 Hanks 液洗 2～3 次以除去血球和脂肪组织。
③加入 0.25% 的胰蛋白酶，摇匀后放 4 ℃ 过夜。
④次日再用 Hanks 液洗涤，弃去上清，共洗 2～3 次。
⑤加入少量含血清的培养基吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。

2、非酶消化法（EDTA  消化法）
①把组织块剪碎，呈 1 mm³ 大小的组织块。
②将碎组织块在平皿中用无钙镁 PBS 洗 2～3 次。
③加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或 EDTA）于 37 ℃ 水浴中作用适当时间（中间可轻摇 1～2 次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。
④弃去上清，加入含有钙、镁离子的培养基中止消化反应，并洗涤 2～3 次后，加入完全培养基。
⑤用吸管吹打，使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。

PriCells 提供：
1. 各种原代细胞、细胞系；
2. 各种原代细胞特制基础培养基；
3. 各种原代细胞培养特制添加剂；

质量高、产品全、售后好、发货快

年底大促销，产品大优惠，请致电：18942917992 李经理（微信同号）
 

武汉原生原代生物医药科技有限公司（原生原代，PriCells）于2009年成立。位于湖北省武汉市东湖高新技术开发区东湖国家自主创新示范区域，总部设立在武汉国家生物产业基地（即光谷生物城——光谷智慧健康园。作为中国首家专业的、专注的研发--生产--销售多种属组织源性细胞产品和提供细胞检测技术服务的生物医药企业，率先独立起草和制定了“基于多种属组织源性细胞分离、培养、运输和检测的PriCells技术流程”的行业专业标 准，已被国际权威学术机构认可，被中国的学术机构和企业单位广泛应用。研发和生产的细胞产品主要面向科研院所、生物技术公司、制药企业研发中心和临床医疗机构。

 

       原生原代（PriCells）—— 细胞产品潜心研发已长达12年

       原生原代（PriCells）—— 细胞产品推向市场突破1000余种

       原生原代（PriCells）—— 细胞产品使用客户单位突破600余家

       原生原代（PriCells）—— 细胞产品学术文章引用累计数突破1180余篇