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高通量超灵敏的主流细胞活力检测方法
人阅读 发布时间：2020-08-28 16:06
高通量超灵敏的主流细胞活力检测方法
细胞增殖检测技术已广泛应用于分子生物学、遗传学、肿瘤生物学、免疫学、药理和药代动力学等研究领域。细胞通过分裂的方式增殖，细胞增殖是生物体的重要生命特征 。细胞增殖的同时，在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，活细胞在总细胞中所占的百分比叫做细胞活力。检测细胞存活与增殖的方法主要包括观察 DNA 合成含量和检测细胞代谢活性两种，前者主要是DNA前体物质（胸腺嘧啶核苷类似物）掺入法，比如 BRDU、EDU 法；后者主要为 MTT、XTT、MTS、CCK-8、WST-1 及 WST-8 法等。在后者中现在灵敏度更高、更适合高通量的方法就是基于细胞内 ATP 含量来进行检测。
本文中从多个维度对上海李记生物新推出的 CellTimer-Light 细胞活力检测试剂盒（以下简称 CT-Li）的性能进行评判，积极推广这种市面尚未铺开的优质产品。因为只有活细胞才能产生 ATP，在细胞凋亡和坏死时ATP又会迅速下降的原理，利用化学发光法检测（一般使用冷光仪或能化学发光的多功能酶标仪）细胞内 ATP 含量（图 1），从而反应细胞活力。
图 1. CellTimer-Light 细胞活力检测试剂盒原理
• 快速简便：仅需 10 分钟即可获取数据；只需一步操作，加入试剂后无需吹打、震荡混匀，且全程室温操作，无需 37℃ 孵育。相较于 MTT、CCK8、Alamar blue 等方法相比，大大提升效率、降低工作量（图2）
• 灵敏度高： 最低可探测到 10 个细胞。
• 稳定性好： 发光信号持久稳定在 96 孔板中，最高 1.0×105个/孔，可在接近20 小时内维持良好的线性（R2>0.995） ，线性范围超过知名国际品牌产品标示的 5-6 万/孔；在 384 孔板中，最高 27500 个/孔，在 13 小时内（未检测更长时间）其线性相关系数 R2>0.998（图 3） 。
• 适用性广： 拥有最低探测 4 个细胞的灵敏度以及超宽的线性范围，96 孔板最高 1.0×105 个/孔，384 孔板最高 27500 个/孔几乎能够满足所有实验的需求，稳定的发光信号和简易的操作保证高通量操作的需求（图 4、5）。
• 质量过硬： 4℃ 存放，信号半衰期超过一个月，且性能仍然能够达到检测要求；30℃ 时半衰期为 2 天，即使 56℃ 半衰期也长达 1 小时（图 6）。经多次测试，一般反复冻融 5 次性能不会出现明显改变。
• 灵敏度高： 最低可探测到 10 个细胞。
• 稳定性好： 发光信号持久稳定在 96 孔板中，最高 1.0×105个/孔，可在接近20 小时内维持良好的线性（R2>0.995） ，线性范围超过知名国际品牌产品标示的 5-6 万/孔；在 384 孔板中，最高 27500 个/孔，在 13 小时内（未检测更长时间）其线性相关系数 R2>0.998（图 3） 。
• 适用性广： 拥有最低探测 4 个细胞的灵敏度以及超宽的线性范围，96 孔板最高 1.0×105 个/孔，384 孔板最高 27500 个/孔几乎能够满足所有实验的需求，稳定的发光信号和简易的操作保证高通量操作的需求（图 4、5）。
• 质量过硬： 4℃ 存放，信号半衰期超过一个月，且性能仍然能够达到检测要求；30℃ 时半衰期为 2 天，即使 56℃ 半衰期也长达 1 小时（图 6）。经多次测试，一般反复冻融 5 次性能不会出现明显改变。
图 2. CT-Li 试剂准备及实验操作流程
图 3. 加入等体积 CT-Li 试剂后， Jurkat 细胞线性相关系数随时间的变化。 A. 白色 96孔板中， 100μ l Jurkat 细胞最高 100000 个/孔（蓝色虚线），2 倍稀释，共设置 11 个浓度，对照组为等体积 1640 培养基含 10 %胎牛血清（ FBS），红色实线为采用最高 50000 个细胞拟合。 B. 白色 384 孔板中， 25μ l Jurkat 细胞最高 27500 个/孔（蓝色虚线），2 倍稀释，共设置 11 个浓度，对照组为等体积 1640 培养基含 10 %胎牛血清（ FBS），红色实线为采用最高 13750 个细胞拟合。
图 4. 96 孔板中各时间点发光信号与细胞数的相关性。各数据点取自图 3A 中相应原始数据，小图为低细胞量段曲线放大图。
图 5. 384 孔板中各时间点发光信号与细胞数的相关性。各数据点取自图 3B 中相应原始数据，小图为低细胞量段曲线放大图。
图 6. CT-Li 试剂在不同存储温度下发光信号随时间变化情况。 检测方法如下，同一批次试剂取 3 份存储于 -20℃，其余分别存放于相应温度并在对应时间点取样立即冻存于 -20℃，样品全部收集完成后用 50μ l 2μ M ATP 溶液（ 1640 培养基含 10%FBS） 加入等体积 CT-Li 试剂检测。 56℃ 极端情况下， 信号半衰期为 1 小时； 30℃ 存放，半衰期为 2 天； 4℃ 保存，信号半衰期超过 37 天，而即使信号衰减一半也完全能够满足检测的需求。
与国外大牌对比实验
评价产品质量的最直接方法是正面对比，我们在 Siha、HepG2、293T 三款细胞上面分别用了上海李记 CT-Li 试剂和国外 P 公司的 CellT** 试剂分细胞数和时间进行了严谨的产品对比验证。实验数据如图 7（篇幅有限，仅展示 Siha）
评价产品质量的最直接方法是正面对比，我们在 Siha、HepG2、293T 三款细胞上面分别用了上海李记 CT-Li 试剂和国外 P 公司的 CellT** 试剂分细胞数和时间进行了严谨的产品对比验证。实验数据如图 7（篇幅有限，仅展示 Siha）
图7，细胞相同(Siha)，分别比较 CT-Li 试剂和 CellT** 两种产品在不同检测时间（10min、120min、240min）时的吸光值。从图中可以看出，每孔细胞数在 500 到 32000 万之间时，随着时间的延长，两种试剂的发光值都有所下降，但组间倍数关系无明显变化，相关性（R²）无明显变化，说明两种试剂都具有较好的稳定性。
| 实验细胞 | 检测时间 | CT-Li相关性（R²） | 国外P*相关性（R²） |
| Siha | 10min | 0.9993 | 0.9931 |
| 120min | 0.9995 | 0.9938 | |
| 240min | 0.9996 | 0.9941 | |
| HepG2 | 10min | 0.9994 | 0.9911 |
| 120min | 0.9991 | 0.9912 | |
| 240min | 0.9995 | 0.9924 | |
| 293T | 10min | 0.9996 | 0.9928 |
| 120min | 0.9992 | 0.9926 | |
| 240min | 0.9997 | 0.9961 |
关于上海李记生物：
上海李记（Shanghai Life-iLab Biotech Co.,Ltd）坐落在美丽的上海川沙古镇，拥有 1400 平米的公司面积，是一家集研发、生产、销售为一体的生物高科技公司。主要产品：FBS、无血清细胞冻存液、细胞转染试剂、CCK-8，蛋白电泳全套试剂，无毒核酸染料、鼠尾直扩裂解液（以上试剂均可免费申请试用装）等涵盖细胞、分子方面各类实验试剂。
目前上海为公司直销模式，合作单位有：复旦大学、上海交通大学、同济大学、上海科技大学、上海药物所、中科院神经所、中科院细胞生化所、和元生物、和记黄埔、药明康德等多家科研单位和医药企业，在全国 16 个城市设有一级代理：北京、武汉、大连、昆明、南京等。
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