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新一代的细胞转染试剂使用方法
人阅读 发布时间:2020-07-10 16:44
该产品具有转染效率高、细胞毒性低、操作简单、重复性好、适用范围广等特点。
使用方法(以 24 孔板为例,其他培养皿中转染请参考表1)
1. 接种细胞
对于贴壁细胞,转染前 18-24 h 进行铺板(不含抗生素),使其在转染时的密度大约在 80% 左右。对于悬浮细胞,转染当天,配制 EZ Trans-DNA 复合物之前进行铺板,每 500 µL 生长培养基中加入 4~8×105cells。【注】:培养液中的血清不影响转染效率。转染试剂使用量受细胞类型及其他实验条件影响,建议初次使用时设置梯度进行优化最佳使用量。
2. 准备 EZ Trans-DNA 复合物
(1)对于每孔细胞,将 1 μg 质粒 DNA 稀释到 40 μL 无血清的高糖 DMEM 培养基(或者 OPTI-MEM Ⅰ 培养基),混匀。
(2)对于每孔细胞,将 3 μL EZ Trans 转染试剂稀释到 40 μL 无血清的高糖 DMEM 培养基(或者 OPTI-MEM Ⅰ 培养基),轻轻混匀。
【注】:无血清的高糖 DMEM 培养基是稀释液,不能使用含血清的培养基进行 DNA 和 EZ Trans 转染试剂的稀释。因为 EZ Trans-DNA 转染复合物的形成过程不能含有血清。
(3)将稀释好的 EZ Trans 转染试剂尽快全部加入到已稀释好的质粒 DNA 中,轻轻混匀。
【注】:此混合的顺序不能反向进行。
(4)室温放置 10-15 min,以形成 EZ Trans-DNA 复合物。
3. 转染细胞
(1)将上述 80 μL EZ Trans-DNA 转染复合物均匀滴入到含细胞的培养皿中。轻轻晃动培养皿或轻微振荡,让 EZ Trans-DNA 复合物分散均匀。
(2)在 37℃,5% CO2 培养箱培养 12-18 h,去除含 EZ Trans-DNA 复合物的培养液,更换新的培养液,继续培养至对转入基因表达分析。
【注】:筛选稳定转染细胞株,转染细胞 24 h后,将细胞传代至新鲜的生长培养基中(将细胞稀释 10 倍以上),在 37℃,5% CO2 培养箱中孵育 24 h,加入筛选培养基。在有转染抗性基因相匹配的药物筛选条件下,约 1~2 周可筛选到耐药性克隆,在这期间需经常更换含筛选药物的生长培养基。
注意事项
1. 质粒质量:请务必使用高纯度无内毒素转染级质粒。通过 260 nm 光吸收测定 DNA 浓度,260 nm / 280 nm 比值确定 DNA 纯度(比值应该在 1.8~2.0 的范围之内)。如有可能,请通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒的完整性。
2. 细胞条件:使用适当保存和经常传代的健康细胞。确保细胞没有被细菌、真菌或支原体污染。如果细胞是近期复苏的液氮冻存细胞,请在转染前至少传代两次。建议使用 GIBCO 或者李记生物的胎牛血清培养细胞。
3. 细胞培养液要求: EZ Trans 细胞转染试剂可用于有血清培养基的转染,并且转染前不需要换培养基。但是,制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释 DNA 和转染试剂,因为血清会影响复合物的形成。确保细胞培养液没有被细菌、真菌或支原体污染。转染时培养液中不添加抗生素。
4. DNA 浓度和 EZ Trans 细胞转染试剂量的优化:DNA 浓度和转染试剂使用量受细胞类型及其他实验条件影响,初次使用应优化 DNA 浓度和转染试剂量以得到最大的转染效率。使用者可尝试每 1 μg DNA 使用 1~4 μL 体积线性 PEI 转染试剂进行优化。DNA 和转染试剂的比例,通常推荐是 1:2~1:5。
表 1:不同培养体积对应的待转 DNA、EZ Trans、稀释液用量
培养器皿 |
培养液体积(mL) |
DNA量(μg) |
EZ Trans (μL) |
稀释液(μL) |
48孔板 |
0.3 |
0.5 |
1.5 |
2 × 25 |
24孔板 |
0.5 |
1 |
3 |
2 × 40 |
12孔板 |
0.75 |
1.5 |
4.5 |
2 × 60 |
6孔板 |
1 |
3 |
9 |
2 × 125 |
35 mm培养皿 |
1 |
3 |
9 |
2 × 125 |
60 mm 培养皿 |
3 |
6 |
18 |
2 × 250 |
100 mm 培养皿 |
9 |
12 |
36 |
2 × 500 |
【注】:该表使用量仅供参考,具体使用量还需根据细胞类型及其他实验条件进行优化。使用时 DNA(μg): EZ Trans 细胞转染试剂(μL)比值保持在 1:2~1:5。
细胞毒性实验
李记客户反馈图片
Huh7 是指人肝癌细胞系,是由 Naka-bayashi 等人建立的,细胞源自一个日本男性高分化肝细胞肝癌,HBV 阴性,能产生一些细胞质蛋白,如白蛋白、a 抗胰蛋白酶、AFP 等。广泛用于肝癌领域研究。Huh7 细胞系的特点:在密度低的时候,是多边形;密度大的时候,偏向于梭形。
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