冻存时刻，零污染攻略：细胞长期保存的安全密钥

        细胞冻存是生物实验室保存珍贵细胞资源、确保实验可重复性的核心技术。然而，冻存过程并非绝对安全，污染风险始终存在。一旦发生污染，不仅意味着珍贵的细胞系丢失，更可能导致后续实验失败、资源浪费，甚至产生误导性结果。因此，在冻存过程的每个环节，严格执行污染预防措施至关重要。本文将详细阐述细胞冻存中主要的污染风险点及其预防方法，并提供关键注意事项。

一、 主要污染源与风险点

1. 微生物污染： 细菌、真菌、支原体是最常见的微生物污染物。它们可能来源于：

   • 操作环境： 超净台/生物安全柜消毒不彻底、气流不稳定、室内空气洁净度差。

   • 操作人员： 无菌操作不规范（如手套、实验服未消毒，说话、咳嗽）、手部清洁不到位。

   • 试剂与耗材： 冻存液、培养基、胰酶等未过滤除菌或已过期；冻存管、吸管、离心管等包装破损或灭菌不彻底。

   • 液氮储存： 液氮罐内部污染（尤其是不常清洗维护的气相液氮罐），液氮本身可能含有微生物（尽管低温下不繁殖，但解冻后可能复活），冻存管密封不严导致液氮渗入。

2. 交叉污染： 不同细胞系之间的混染，主要源于：

   • 操作失误： 同时处理多种细胞时，吸管、枪头、培养器皿混用或操作台面/设备清洁不彻底。

   • 冻存管标识不清或错误： 导致解冻时取错细胞。

   • 液氮储存： 冻存管在液氮罐中破裂或密封不严，内容物泄漏污染邻近冻存管或液氮。

二、 污染预防的核心方法

1. 环境与设备的严格把控：

   • 超净台/生物安全柜： 确保其性能达标（定期检测风速、洁净度），每次使用前后彻底清洁消毒（75%乙醇擦拭台面、内壁，并开启紫外灯照射足够时间）。操作时尽量减少进出动作，避免扰乱气流。

   • 实验室环境： 保持实验室清洁，定期消毒。限制无关人员进入细胞操作区域。

   • 液氮罐管理： 定期清洁液氮罐内部（根据使用频率，建议每3-6个月或至少每年一次），移除可能存在的污染物和破碎管。使用气相液氮储存（将冻存管悬挂在液氮蒸气中而非直接浸入液氮）是降低液氮直接污染风险的最佳实践。确保液氮罐盖子密封良好。

2. 试剂与耗材的无菌保障：

   • 来源可靠： 使用来源清晰、质量可靠的试剂（培养基、血清、冻存液、胰酶等）。血清需进行严格筛查（如支原体检测）。

   • 过滤除菌： 所有自行配制的液体（尤其是冻存液）必须使用0.22 μm滤膜过滤除菌。现配现用或分装后于-20℃短期保存（避免反复冻融）。

   • 耗材无菌： 使用一次性无菌耗材（冻存管、吸管、离心管、枪头等）。检查包装完整性，确保在有效期内。开启包装前用75%乙醇擦拭外包装。

3. 操作人员的规范与自律：

   • 个人卫生： 进入细胞房前洗手，穿戴清洁的实验服、口罩、帽子、手套。操作前用75%乙醇喷/擦手套。

   • 无菌操作： 这是预防污染的重中之重！所有操作在超净台/生物安全柜内进行，动作迅速、准确、轻柔。避免手或物品经过敞开的培养皿/管口上方。瓶盖、管盖内面朝上放置，避免触碰台面。移液器吸液、排液动作要稳，避免产生气溶胶。严禁在操作区内交谈、说笑、咳嗽。

   • 专管专用： 处理不同细胞系时，务必更换手套，清洁台面，并使用专用的移液器和吸头/吸管。一次只处理一种细胞。

4. 冻存过程本身的优化：

   • 细胞状态： 冻存处于对数生长期、活力旺盛（>90%）、无污染的细胞。冻存前务必进行微生物检测（尤其是支原体）。

   • 高浓度冻存： 细胞悬液浓度足够高（通常10^6 - 10^7 cells/ml），减少冻存体积，降低污染机会。

   • 程序降温： 使用程序降温仪或“异丙醇梯度冻存盒”进行缓慢降温（通常-1℃/min），避免冰晶损伤细胞形成裂解物，这些裂解物可能成为微生物滋生的温床。切勿将细胞直接放入-80℃或液氮！

   • 冻存管密封： 使用质量可靠、带有内旋盖和硅胶垫圈的冻存管。拧紧盖子后，用封口膜或冻存管保护套（如Cryoflex™）缠绕管口，提供双重密封，防止液氮渗入或管内容物泄漏。确保管盖螺纹处清洁干燥。

5. 储存与复苏的谨慎操作：

   • 清晰标识： 冻存管上使用永久性记号笔清晰标注：细胞名称/代号、代数、冻存日期、操作者姓名。强烈建议使用双重标签（管身标签+管盖标签或悬挂标签），并在记录本/电子系统中详细登记冻存位置（液氮罐编号、提桶/架子位置、行/列号）。

   • 液氮罐管理： 将冻存管置于气相液氮中储存。定期检查液氮液位，及时补充。存取细胞时动作要快，尽量减少冻存管暴露在室温空气和液氮蒸气中的时间。存取时佩戴防冻手套和护目镜。

   • 安全复苏： 从液氮罐中取出目标冻存管时，立即放入37℃水浴锅中快速摇晃融化（水面勿超过管盖）。融化后立即用75%乙醇擦拭管身外部（尤其是管口螺纹处）再移入超净台操作。复苏后培养基中加入适量抗生素（如双抗）仅作为临时预防措施，不能替代无菌操作，且应尽快撤除。

三、 关键注意事项

1. “无菌”是意识，更是习惯： 将无菌操作理念融入每一次操作细节中，形成肌肉记忆。

2. 定期检测是保障： 即使严格遵守规程，也应定期对库存细胞（特别是珍贵细胞）进行复苏培养并检测微生物污染（细菌、真菌、支原体）。

3. 液氮罐是污染重灾区： 务必重视液氮罐的定期清洁维护和使用气相储存。气相储存虽不能完全杜绝污染，但风险远低于液相储存。

4. 密封性是关键： 冻存管密封不严是导致液氮渗入和交叉污染的主要原因之一。务必选用合格冻存管并确保拧紧、密封良好。

5. 记录与溯源： 详细的冻存记录（细胞信息、位置、操作者、日期）是管理和溯源的基础，一旦发现问题，有助于快速定位和排查。

6. 应急预案： 制定冻存管破裂、液氮泄漏等意外情况的应急预案，包括人员防护、污染处理和环境消毒。

结论：

      细胞冻存是细胞资源长期保存的基石，而污染是威胁其安全性的最大敌人。通过严格的环境控制、可靠的无菌试剂耗材、规范的无菌操作技术、优化的冻存程序、安全的储存策略（特别是气相液氮储存和冻存管密封）以及严谨的管理记录，可以最大程度地将污染风险降至最低。北京百欧博伟生物有限公司深知细胞资源的宝贵，我们建议将上述污染预防措施纳入标准操作规程，并持续对操作人员进行培训和监督，确保每一份冻存的细胞都安全、纯净，为后续研究和应用提供坚实的基础保障。