如何成功培养原代细胞?掌握这些关键技巧!

　　深入理解细胞的生长需求是成功培养原代细胞的首要步骤。原代细胞既可以选择悬浮培养，也可以选择贴壁培养，这主要取决于细胞的特性。例如，某些细胞自然会在悬浮液中生长，而不依赖于表面附着，如外周血来源的细胞。同时，经过特定修饰的细胞系能够在悬浮状态下茁壮成长，其生长密度甚至超越了粘附条件下的限制。另一方面，对于那些需要贴壁才能生长的原代细胞，如实体组织来源的细胞，提供一个适宜的表面显得至关重要。

　　细胞贴壁的过程

　　这些细胞通常在无涂层扁平塑料容器中培养，有时也会在微载体上培养，并可能用细胞外基质蛋白（如胶原蛋白和层粘连蛋白）进行包被，以增强其粘附能力并提供生长和分化所需的其他信号。细胞培养基是由基础培养基加入适量的生长因子和细胞因子调配而成，细胞在细胞培养箱中生长，并维持在恒定的温度和混合气体环境中（对于哺乳动物细胞，通常为37°C，5％CO2）。由于细胞类型的差异，培养条件也会有所不同，例如生长培养基的pH值、葡萄糖浓度、生长因子和其他营养物质的含量。

　　在建立原代培养的过程中，必须向生长培养基中添加抗生素以防止宿主组织带来的污染。常用的抗生素包括庆大霉素、青霉素、链霉素和两性霉素B的混合物。然而，长期使用抗生素可能对细胞产生毒性，因此需谨慎使用。

　　分离后保留原代细胞的活力至关重要，因为这些细胞往往会经历衰老过程，并在达到一定数量的种群倍增后停止分裂。为了确保细胞的长期存活，必须具备精湛的细胞培养技术以及适宜的培养条件，包括生长培养基、温度、气体混合物、pH值、生长因子浓度、营养物质和葡萄糖等。用于补充培养基的生长因子通常来源于动物血液，使用时需格外小心以避免污染，并建议尽可能减少或消除这些成分的使用。在操作过程中，必须严格遵循无菌技术要求。

　　细胞融合（Cellular Confluence）

　　细胞融合是指附着在培养容器中的细胞所占的百分比。例如，当细胞融合达到100％时，意味着培养皿表面被细胞完全覆盖；而50％的细胞融合则表示大约一半的表面被细胞占据。对原代细胞培养的跟踪和融合终点的评估是至关重要的，因为不同的细胞类型需要不同的融合程度来进行传代培养。

　　继代保持（Maintenance and Subculture）

　　当分离的细胞在培养皿上稳定附着后，细胞的维持阶段便开始了。这一过程通常在培养开始后的24小时左右发生。一旦细胞达到所需的细胞融合百分比并开始活跃增殖，便可以进行传代培养。在达到100%融合之前进行传代是最佳时机，因为融合后的细胞可能会发生分化，导致传代后的增殖速度变慢。

　　对于依附依赖性细胞，它们以单层形式生长，需要定期用适当的培养基进行传代培养，以维持其指数生长状态。继代培养涉及到细胞间和细胞内表面间键的断裂。大多数粘附的原代细胞需要消化其蛋白质附着键，或者用低浓度的蛋白水解酶（如胰蛋白酶/EDTA）从单层或相关组织中分离出来。细胞解离后形成单细胞悬液，经过计数和适当稀释，再转移到新鲜的培养容器中（培养基的组成因细胞类型而异）。在此处，它们会重新附着并开始分裂。

　　继代保持的示意图如下：

　　在继代培养的过程中，细胞计数是一个关键环节。为了准确估计细胞数量和判断细胞活力，通常会使用血细胞计数器。这种计数器是一种特制的玻璃显微镜载玻片，上面刻有矩形凹痕，形成一个用于计数的腔室。腔室上还精心制作了激光蚀刻的垂直线栅格，使得面积和深度都是已知的。通过这种方法，我们可以对特定体积的流体中的细胞进行精确计数，进而推算出整个流体的细胞浓度。

　　白细胞计数板示意图

　　细胞计数原理

　　细胞计数板的中央设有两个细胞计数池，其上刻有激光蚀刻的网格。该网格由9个主要方格组成，其中角上的四个方格被进一步细分为16个更小的方格，而中央的主要方格则被划分为25个更小的方格。每个小方格又被进一步细分为16个微型方格。在每个细胞计数池的远端，都设有上样口，待计数的细胞样品就是通过此处加入。

　　细胞计数板的实验步骤

　　在开始计数之前，需用酒精和无尘布清洁细胞计数池和盖玻片，以去除纤维、指纹或水印。随后，轻轻打散细胞悬浮液，确保细胞能尽可能地分散成单个细胞。

　　使用微量移液器吸取10微升的细胞悬浮液，通过上样口加入。由于毛细作用，悬液会进入细胞计数池并填满整个网格。

　　等待细胞静置后，选择合适的物镜，将细胞计数板置于显微镜的载物台上。

　　在显微镜下观察细胞。若每个大方格内的细胞数少于5个，则需重新离心样品并使用更小的体积重悬细胞；若细胞出现相互重叠或因密度过大而难以区分，则需进一步稀释样品至更大的体积。（请注意记录稀释倍数，以便后续计算细胞浓度。）

　　计数时，根据样品中细胞的密度来选择合适的方格进行计数。若细胞数量较少，只需计数一个角落方格中的所有细胞；若细胞数量适中，可选择16个较小方格中的一个进行计数；若细胞密度很高，则需计数中央25个小方格中的一个。无论选择哪种方格进行计数，每个方格中至少应有20-50个细胞以确保准确度。

　　遵循计数原则：只记录位于方格线上的细胞，即“记上不记下，记左不记右”。同时，计算四个同样大小方格内的平均细胞数，以得到每毫升体积中的细胞数目。将平均细胞数乘以10000（因为网格中的大方格体积为万分之一毫升）即可得到结果。

　　最后，根据所计数的方格类型进行乘法运算。若只计数了一个大方格，则乘1；若计数了较小的方格，则乘16；若计数了25个中央方格中的一个，则乘25。若细胞悬浮液在上样前已稀释过，还需乘以相应的稀释倍数以得到最终的细胞浓度。

　　8、细胞总数的计算：若已知每毫升细胞数为5E6个/mL，且样品总体积为5mL，则该样品中的细胞总数为5E6个/mL乘以5mL，即2.5E7个细胞。若所取的细胞悬液经过稀释，还需乘以相应的稀释倍数。

　　9、细胞计数完成后，务必清洁盖玻片和细胞计数池，以备下次使用。

　　接下来，我们谈谈细胞的冷冻保存与恢复。

　　冷冻保存是保持活细胞结构完整性的重要技术。对于原代细胞，正确的冷冻和融化过程至关重要，以确保最大程度地减少细胞损伤和死亡。在适当的温度和冷冻速率下，通过添加冷冻保护剂（如DMSO或甘油）至细胞培养基中，可以实现细胞的冷冻保存。对于大多数原代细胞，推荐在80%完全生长培养基与10%FBS及10%DMSO的混合物中进行冷冻。冷冻过程应缓慢进行，以每分钟-1°C的速度为宜，从而最大程度地减少细胞内冰晶的形成。冷冻后的培养物应存放在液氮（-196°C）或低于-130°C的气相中。

　　解冻冷冻保存的细胞是一个相对快速的过程，通常只需将冷冻的细胞置于37°C水浴中浸泡约1-2分钟。在此过程中，需特别留意避免在细胞融化后进行离心操作，因为这些细胞对冷冻保存恢复过程中的损伤非常敏感。最佳做法是在细胞融化后直接进行铺板，并确保培养物在最初的24小时内能够稳固附着。当开始启动冷冻保存的原代细胞培养时，务必在细胞附着后立即移除使用过的培养基，因为DMSO可能对原代细胞产生不利影响，并可能导致解冻后的细胞活力下降。